SV40T转基因小鼠纯合子品系的建立及其发病机制的研究

摘要

猴空泡病毒40(SV40),是一种DNA病毒,SV40T是SV40中调节细胞周期的重要蛋白,其在体外可使人及动物的多种组织类型正常细胞发生恶性转化,常用于转基因动物的制作,在转基因小鼠体内可诱发多种肿瘤形成。体外实验证实SV40工具有与抑癌蛋白P53,PRb等形成特异性复合物的能力,使它们的抑癌活性丧失,从而促使细胞的恶性转化。
　　 在本课题的前期研究中,利用显微注射法制备了胃壁细胞特异性表达SV40T抗原的转基因小鼠。通过近两年的传代,SV40T基因已经在小鼠体内稳定遗传和表达,并已致成了小鼠胃粘膜的增生和癌变。本研究通过荧光定量PCR筛选,测交验证和全同胞交配,建立了胃壁细胞特异性表达SV40T抗原的纯合子转基因小鼠品系,并鉴定了8个品系的外源基因拷贝数；通过免疫共沉淀和Westernblot验证了SV40T在小鼠体内与抑癌蛋白P53形成了复合物,致成P53蛋白的部分失活,可使P53对其下游基因bcl-2失去抑制,bcl-2基因在转基因小鼠的胃粘膜中过量表达,这可能是转基因小鼠发生胃部病变的因为之一。
　　 方法：
　　 一.纯合子转基因小鼠品系的建立
　　 1.小鼠的传代:将F0、F1代中的阳性转基因小鼠分别与野生型B6鼠进行交配,获得F1、F2代鼠。F2代阳性鼠间进行全同胞兄妹交配,获得F3代转基因小鼠,根据孟德尔定律F3代中应该至少有25％的纯合子。通过荧光定量PCR的2-ΔΔCt法筛选纯合子小鼠。
　　 2.纯合子小鼠的验证与品系的建立:将用荧光定量PCR筛选出的纯合子小鼠与B6鼠进行测交,检测后代鼠来验证荧光定量PCR的结果。最后将纯合子小鼠按全同胞交配方式建立纯合子SV40T转基因小鼠品系。
　　 3.外源基因拷贝数的鉴定:采用相对定量的2-ΔΔCt法,用单拷贝基因β2m(β2微球蛋白)作为内参照。用已知的杂合子小鼠作为模板,以2-ΔΔCt计算出的结果要乘以2才是基因组中外源基因的拷贝数。
　　 二.转基因小鼠胃部病变因为的研究
　　 1.转基因小鼠胃酸分泌情况的检测。取野生型B6鼠和各品系转基因鼠若干只,禁食一天后吸取胃液检测pH值。
　　 2.通过石蜡切片和HE染色来观察转基因小鼠胃部的病变情况。取野生型B6鼠和胃部病变严重和不严重的转基因鼠若干只,取胃组织进行常规切片、HE染色后观察转基因鼠胃粘膜的形态变化。
　　 3.通过免疫共沉淀和Western blot技术验证外源的SV40T蛋白能在小鼠体内与内源的P53蛋白结合。
　　 4.通过RT-PCR来检测P53蛋白下游的3个主要基因bax、p21、bcl-2和两个胃壁细胞特异性基因H+/K+ATPase、内因子的表达情况。
　　 结果：
　　 一.纯合子小鼠品系的建立
　　 1.小鼠的传代与纯合子的筛选:用定量PCR法在6个转基因小鼠品系中选育出17只纯合子小鼠。
　　 2.纯合子转基因小鼠的验证与品系的建立:经过测交验证它们与野生型小鼠所生的后代都为阳性,证明了荧光定量PCR的结果是正确的,通过纯合子之间的全同胞交配建立了6个独立的纯合子品系。
　　 3.得到了8个品系的转基因小鼠中外源基因的拷贝数,其中16＃、57＃、61＃品系中SV40T基因的拷贝数为1；4＃、24＃、51＃品系中SV40T基因的拷贝数为2；73＃品系中SV40T基因的拷贝数为3；2＃品系中SV40T基因的拷贝数为5。
　　 二.转基因小鼠胃部病变因为的初探
　　 1.转基因小鼠胃酸值的测定。发现并不是所有的转基因小鼠的胃酸值都不正常,而是在不同的品系有不同的比例。其中2＃和73＃转基因小鼠品系中胃酸值不正常的小鼠比例最高。
　　 2.通过石蜡切片和HE染色来观察转基因小鼠胃部的病变情况。在病理切片中可以看到转基因小鼠的胃粘膜发生了明显的增生,成熟壁细胞的数量减少或消失,一些病情较严重的小鼠胃粘膜出现了早期癌变的症状。
　　 3.通过免疫共沉淀和Western bolt技术证明了外源蛋白SV40T在小鼠体内与内源蛋白P53形成了复合物。
　　 4.通过RT-PCR发现在转基因小鼠中本应该由P53蛋白所抑制表达的bcl-2基因的表达量反而比未转基因小鼠有了明显的增高,而bax和p21基因的表达量也出现了增高。在胃部病变较严重的小鼠中由于胃壁细胞的大量凋亡,使两个胃壁细胞特异性基因H+/K+ATPase、内因子的表达都出现了明显的降低。
　　 结论：
　　 1.建立了6个SV40T转基因小鼠的纯合子品系,并得到了8个品系的转基因小鼠中外源基因SV40T的拷贝数。
　　 2.SV40T在小鼠体内与内源蛋白P53形成了复合物。使P53失去了对前凋亡基因bcl-2的抑制,使壁细胞未能及时凋亡,而导致转基因小鼠的胃粘膜的增生。以后也出现了大量细胞的凋亡,bax和p21基因可能参与了这个过程。壁细胞数量大量减少导致盐酸分泌减少使胃内微生物的繁殖和亚硝胺的形成更加速了胃粘膜的病变。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分

材料与方法

实验结果

讨论

小结

总结

下一步的工作和建议

参考文献

综述

参考文献

英文缩略词

致谢

个人简历