慢病毒介导APP695基因RNAi对APP695转基因小鼠皮质神经元Aβ分泌及凋亡的影响

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者的大脑皮层、海马等处大量的老年斑(senile plaques，SP)形成，是其最主要的病理特征之一。β—淀粉样蛋白(beta—amyloid，Aβ)是SP的核心成份，Aβ是它的前体蛋白——β—淀粉样蛋白前体(amyloidβ—protein precursor，APP)的代谢产物，APP根据其氨基酸长度的不同，主要以三种类型存在，即：APP695，APP751和APP770，而在脑组织中主要是APP695。一些证据表明，APP的过量表达可能是导致Aβ产生的原因之一。Palmert最早发现，AD脑蓝斑神经元和基底核中APPmRNA升高达2倍，并确认是由于APP695 mRNA选择性升高所致。贾艳滨等发现AD患者血浆中APPmRNA的水平显著高于正常人。
　　 但是减少APP的生成是否可以减少Aβ的沉积，国内还未有报道。国外虽有少数报道，但未使用皮质或海马神经元作为研究对象，而是使用高表达APP的CHO(Chinese hamster ovary)细胞作为研究对象，更未使用APP转基因鼠作体内外研究。AD转基因动物模型因为它具有明确的AD的病因，并且可以反应AD主要的病理和功能上的变化，有希望成为研究老年性痴呆的理想的动物模型。我们选用C57BL/6J—APP转基因小鼠，它是将含有全长突变的人APP cDNA695 V717Ⅰ基因转入C57BL/6J小鼠，可以过表达APP695基因，分泌较多内源性的Aβ多肽，能够部分复制出AD的重要分子生化和病理改变，是目前研究AD基因治疗的最佳动物模型之一。
　　 因此我们应用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，选用体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元作为研究对象，构建APP695—shRNA慢病毒表达载体，使其感染皮质神经元，观察APP695—shRNA—LV对APP695基因和APP695蛋白有无抑制作用，并检测Aβ的生成，应用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测神经元的活性和流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡，观察RNA干扰APP695基因后神经元的代谢及功能变化，从而试图为进一步探讨AD的病因以及可能的治疗途径提供新的思路。
　　 本研究分为以下三个部分：
　　 第一部分 APP695转基因阳性小鼠的鉴定及原代皮质神经元的培养
　　 方法：
　　 1．APP695转基因阳性小鼠的鉴定。
　　 1．2鼠尾DNA提取。
　　 1．3 PCR扩增。
　　 1．4琼脂糖凝胶电泳。
　　 2原代皮质神经元的培养
　　 3神经元的鉴定
　　 3．1取培养7天的神经元用台盼蓝染色，计数神经细胞存活率达到95％以上用于神经元鉴定。细胞存活率的计算：细胞存活率(％)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100。
　　 3．2 NSE鉴定神经元
　　 结果：
　　 1．采用PCR扩增技术，通过琼脂糖凝胶电泳分离，在284bp附近有一条明亮的带，与目的基因APPDNA片段的预期位置相符，鉴定的阳性鼠占80％左右。
　　 2．分离培养的神经细胞，24h后大部分细胞贴壁生长，伸出较长的突起，呈蝌蚪样、不规则形，生长旺盛。2～3d，从胞体伸出的突起增长增多，有的呈双极或多极突起，能较明显地分辨神经元与残留的胶质细胞。6～7d，神经细胞的生长更加活跃，胞体增大，突起交织成网状，形成神经细胞网络。
　　 3．7d神经元台盼蓝染色法测定细胞存活率为(97．1±2．3)％。NSE鉴定：阳性细胞胞浆呈棕黄或棕黑色，而阴性细胞胞浆不着色。培养7d神经元NSE阳性率为(92．6±4．1)％。
　　 第二部分慢病毒介导APP695基因RNAi对APP695转基因小鼠皮质神经元Aβ分泌的影响
　　 方法：
　　 1．实验分组
　　 实验分为未经病毒感染(CON)组、阴性对照病毒感染(NC)组和慢病毒介导阳性干扰(APP695—RNAi)组。
　　 2．慢病毒感染原代皮质神经元
　　 APP695一RNAi慢病毒载体靶点为：5’—CATGCACATGAATGTCCAG—3’，同时设计一条阴性序列作对照，该阴性序列与小鼠、大鼠和人基因组缺乏序列同源性。阴性对照序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT。神经元细胞分离后第4d，将稀释好的病毒液加入细胞中(感染复数MOI=1)，72h后荧光显微镜下观察荧光。
　　 3．FQ—RT PCR检测mRNA表达
　　 3．1总RNA抽提：根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行。
　　 3．2 RNA逆转录成cDNA：根据Promega公司的M—MLV操作说明书进行。
　　 3．3 FQ—RT PCR检测。
　　 3．4 FQ—RT PCR数值分析：采用2—ΔΔCt分析法，以2—ΔΔCt表示CON组和APP695一RNAi组相对NC组APP695基因的相对表达水平，从而比较APP695基因在不同实验组和对照组中的表达差异。其中Δ Ct=目的基因Ct值—Actin Ct值，—△△Ct=NC组△Ct平均值—各样品△Ct，APP695基因表达抑制率(％)=(1—2ΔΔCt)×100％。
　　 4 Western blot检测APP695蛋白的表达
　　 4．1细胞总蛋白抽提。
　　 4．2上样样品准备：每个样品取相同总蛋白量，加入相同体积的2X loadingbuffer上样缓冲液。
　　 4．3 SDS—PAGE。
　　 4．4免疫印迹(湿转)：电泳结束后，将蛋白转移到PvDF膜上。
　　 4．5免疫显色：一抗使用：鼠抗人APP695单克隆抗体(MILLIPORE公司)，二抗使用：羊抗鼠(Santacruz公司)。
　　 5 Elisa法检测Aβ40
　　 结果：
　　 1．慢病毒感染皮层神经元：感染后72 h后荧光显微镜下可见GFP的表达，约有超过80％的细胞发出绿色荧光。
　　 2．转基因小鼠皮质神经元中APP695基因mRNA的变化：APP695—RNAi组APP695基因mRNA的抑制率为76．70％，与NC和CON三组相比有显著性差异(F=281．553，P<0．001)；进一步两两比较，APP695—RNAi组与NC组(P<0．001)及APP695—RNAi与CON组(P<0．001)均有显著性差异；而NC组与CON组APP695基因mRNA的抑制率无显著性差异(P=0．115)。
　　 3．RNA干扰后APP695蛋白表达的变化：Western blot结果显示，与NC和CON组细胞比较，APP695—RNAi组细胞APP695蛋白表达水平明显下降，提示RNAi通过沉默APP695基因而显著抑制了APP695蛋白的表达。
　　 4．APP695—RNAi对细胞分泌Aβ的影响：Elisa结果显示，干扰72h后APP695—RNAi组、NC组、CON组Aβ40的分泌分别为184．04±14．81pg/ml、646．65±30．22pg/ml、655．83±39．88pg/ml。APP695—RNAi组较NC组和CON组Aβ40的分泌分别下降了71．54％和71．94％，有显著性差异(均为P<0．001)；而NC组与CON组Aβ40的分泌无显著性差异(P=0．722)。
　　 第三部分慢病毒介导APP695基因RNAi对APP695转基因小鼠皮层神经元活性和凋亡的影响
　　 方法：
　　 1．MTT检测细胞活性：细胞的活性用OD值表示；细胞的存活率以正常对照组OD值均数为100％，用公式进行计算：细胞存活率(％)=各孔OD值/正常组OD值均数×100。
　　 2．流式细胞术检测细胞凋亡。
　　 结果：
　　 1．MTT细胞活性的测定：24h、48h和72h各组的0D值均有明显差异(P<0．001)，APP695—RNAi组细胞存活率上升，与NC组相比在48h和72h时间点差异显著(P=0．020和P=0．001)。
　　 2．流式细胞术细胞凋亡的检测：感染72h后流式细胞术检测到细胞的凋亡，APP695—RNAi组凋亡率为0．433±0．088％，与 NC(5．23±0．088％)和CON(5．10±0．058％)三组相比有显著性差异(P=1186．824，P<0．001)；进一步两两比较，APP695—RNAi组与NC组(P<0．001)及APP695—RNAi与CON组(P<0．001)均有显著性差异；而NC组与CON组无显著性差异(P=0．280)。
　　 结论
　　 1．使用APP695的shRNA慢病毒表达载体成功感染体外培养的APP695转基因小鼠皮质神经元(感染复数MOI=1)。
　　 2．FQ—RT PCR检测干扰组APP695基因mRNA明显下降。
　　 3．Western blot检测APP695蛋白水平表达下降与FQ—RT PCR一致。
　　 4．Elisa检测干扰组Aβ40的分泌明显下降。
　　 5．通过MTT证实慢病毒介导APP695基因RNA干扰，可以提高转基因小鼠皮质神经元的存活率。
　　 6．通过流式细胞术证实慢病毒介导APP695基因RNA干扰，可以减少细胞的凋亡。