大鼠肝脏部分切除术后肝脏再生及微小肝癌复发的实验研究及其干预策略

摘要

背景和目的：肝细胞癌简称肝癌，居全世界癌症发病率的第5位，死亡率居第3位，年死亡约600000例。手术切除包括肝脏部分切除术和肝移植术，是目前唯一有可能根治HCC的方法。然而，术后肿瘤复发成为影响肝癌患者预后的主要因素之一，现多认为其与术后残余肝脏中的肝内微小转移灶的播散或原发潜伏癌灶的复燃有关。
　　 肝脏再生是肝脏部分切除和肝部分移植术后经历的自然过程，也是肝脏外科医生术前必须考虑的因素，剩余健康肝脏的体积和再生能力制约着外科手术切除范围和患者的预后。肝脏外科的手术应激和缺血损伤以及术后肝脏再生过程伴随的细胞和分子生物学的改变，可能激活潜伏的微小癌灶、加速肿瘤的代谢和转移的进程。因此，权衡如何抑制肿瘤复燃、维持剩余肝脏功能并促进外科术后肝脏再生就成为临床肝脏外科的难点和重点。
　　 本研究首先假设肝脏部分切除术后肝内肝癌微小转移灶或原发潜伏癌灶的肝癌细胞增殖加速、侵袭性增强，并与切除体积相关。在建立大鼠肝脏部分切除术后肝内微小肝癌复发模型的基础上，探寻肝脏部分切除术、肝脏再生和肝癌复发之间的关系。
　　 然后，从肝癌活化、增殖与肝脏再生的分子机制的不同点入手，观察Sorafenib对不同肝细胞、肝癌细胞以及大鼠微小肝癌复发的影响，寻找抑制肿瘤和维持肝脏基本功能、促进肝脏再生的药物干预方案。
　　 最后，从肝癌、肝脏再生与干细胞理论的联系为切入点，进一步探究肝脏再生与微小肝癌复发的其演变及其机制，为抑制术后肿瘤复发、促进肝脏再生提供新的理论依据和治疗途径。
　　 材料和方法：Buffalo大鼠实施0％-80％不同体积的肝脏部分切除术，同时在肝右下叶被膜下种植含McA-RH7777肝癌细胞悬液(1.0×106/0.2ml)来建立肝脏切除术后微小肝癌复发模型，70％肝脏部分切除的大鼠作为对照。记录大鼠肝脏部分切除术后21天，大鼠的体重、肿瘤的体积和数量；术后第3、7和21天，血清肝脏功能指标和免疫染色法检测肝组织Cyclin D1和Ki-67来反映肝脏再生；术后21天，免疫染色法检测肿瘤和肝组织中甲胎球蛋白(α-fetoprotein，αFP)、Ki-67、Cyclin D1、Calpain-small subunit1(CAPNS1)、CD34和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，比较肿瘤增殖情况和侵袭性。术后3、7和21天肝脏再生组织，CK19和αFP免疫荧光双重染色判定肝卵圆细胞活化状态。
　　 Sorafenib溶解于DMSO，配置成含0.1-10μM浓度梯度，DMSO按照0.1％(v/v)的浓度加入细胞培养液；通过3H-Thymidinine细胞增殖实验和MTT细胞活性实验比较Sorafenib对大鼠肝脏原代细胞和肝癌细胞系的体外增殖和细胞活性作用的差异，免疫染色法检测MAKT/AKT细胞信号传导通路活性的变化。大鼠活体实验中，Sorafenib溶解于混合的蓖麻油聚氧乙烯醚；70％肝脏部分切除术、在肝右下叶被膜下种植含McA-RH7777肝癌细胞的Buffalo大鼠，术后每日按照2.5和10mg/kg管饲Sorafenib混合液；术后21天，记录大鼠的体重、肿瘤的体积和数量，免疫染色法检测肿瘤组织中肿瘤指标(Cyclin D1、Ki-67、αFP、CD34和VEGF)的水平，血清肝脏功能指标和免疫染色法检测肝组织再生指标(Cyclin D1和Ki-67)来反映肝脏再生。
　　 结果：
　　 1.实施肝脏部分切除术的大鼠，肿瘤体积显著性增加(P<0.05)，与肝脏切除体积、肝脏再生程度正相关；随着切除体积的增加，肿瘤组织中Cyclin D1、αFP、Ki67、CAPNS1、CD34和VEGF等表达上调(P<0.05)，肺浸润、转移的肿瘤细胞数量增加(P<0.05)。
　　 2.Sorafenib和EGF培养的肝脏原代细胞活性、增殖能力和MAKT/AKT信号通路激酶活性均显著高于肝癌细胞McA-RH7777、Bel7402和HepG2细胞(P<0.05)；实施70％肝脏部分切除术和肝癌细胞种植的大鼠管饲Sorafenib后，在术后21天肿瘤体积、数量以及远处转移显著性减少(P<0.05)，肝脏再生水平无变化(P>0.05)。
　　 3.动态观察肝脏部分切除术后肝脏再生与微小肝癌复发的变化：在术后3-7天，出现肝脏再生峰值；术后7-21天，70％和80％肝脏切除组的肝脏卵圆细胞活化；术后7-21天，随着切除体积的增加，大鼠体重下降、肝脏功能恶化(P<0.05)，肿瘤体积增加。
　　 结论：本研究使用0％-80％不同切除体积的大鼠肝脏部分切除术、在保留的肝右下叶种植肝癌细胞来建立大鼠肝脏部分切除术后微小肝癌复发模型，术后观察21天来模拟临床上肝脏切除术后潜伏的肝癌转移灶或原发性微小肝癌早期复发和转移。结果证实，微小肝癌增长和转移的程度与肝脏部分切除术的体积以及肝脏再生的程度有关。
　　 在肝脏再生促进肝癌术后微小肝癌增殖、转移的研究基础上，利用肝肿瘤细胞和肝细胞MAPK/AKT细胞信号传导通路的表达差异，使用RAF靶向抑制剂Sorafenib抑制肿瘤的增殖和远处转移，对肝脏再生没有影响的条件下、有效地抑制了处于增殖状态下的肿瘤细胞复发和转移，对肝癌术后的辅助治疗提供实验证据。
　　 通过对肝脏切除术后微小肝癌复发和肝脏再生情况的动态观察和对肝内肝脏干细胞的检测，证实了再生肝脏中肝干细胞的活化、与肝脏切除体积和肿瘤的侵袭性有关，推测肝脏干细胞可能参与了术后肝脏再生以及微小肝癌的术后肝内转移。这很可能为肝癌术后抑制肿瘤复发、促进肝脏再生提供了一条新的治疗思路。