PLAG1和PLA2G2A在肝癌中的异常表达

摘要

背景与目的：
　　 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma， HCC，简称肝癌)位居恶性肿瘤发病率的第5位，死亡率第3位，其中一半以上病例发生于中国。肝癌起病隐匿，进展迅速，转移快，死亡率高，对我们的生命健康造成了很大威胁。近些年人们大多认为肝癌的发生是多途径、多因素、多阶段长期作用的结果。目前已知的导致肝癌发生的相关因素包括外部促癌因素（感染HBV、HCV、细菌和寄生虫，药物，摄入黄曲霉毒素，饮酒，非酒精性脂肪肝，胆管疾病与肝硬化等）和患者自身遗传因素，其中HBV感染尤为重要。它们可损伤肝组织，使肝细胞异常增生，严重损坏肝脏实质结构和胆管系统，直接或间接地导致肝癌发生。
　　 目前治疗肝癌的首选治疗方法是外科手术切除，它联合应用TACE、射频消融术、放疗和中医疗法等，可明显提高肝癌患者的5年生存率，而肝移植和生物治疗是其新热点。肝癌的发生发展过程很复杂，常同时存在原癌基因突变、抑癌基因缺失、细胞周期调控与细胞信号转导基因、免疫相关基因和DNA修复基因的异常表达等。分子生物学研究正为肝癌的早期诊断与分子靶向治疗寻求新的突破。最早发现且应用最广泛的血清肿瘤标志物是AFP(α-fetoprotein)，然而它的假阴性率大于30％，当前尚无任何标志物可诊断所有肝癌，我们需要通过联合检测来提高肝癌的早期检出率，因此发现新的标志物有重大意义。
　　 前期通过运用寡核苷酸芯片筛选出肝癌和肝硬化差异基因表达谱，发现多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene1， PLAG1)在肝癌中是一个明显高表达的基因，而ⅡA分泌型磷脂酶A2(groupⅡA secretory PhospholipaseA2， PLA2G2A)基因是一个明显低表达的基因。PLAG1位于人类染色体8q12，已发现在腮腺多形性腺瘤、脂母细胞瘤等多种肿瘤中异常表达，其可通过激活靶基因促进细胞增殖引起肿瘤的发生发展。PLA2G2A属磷脂酶A2家族中的一种，已发现PLA2G2A在抗菌、炎症反应和抑制肿瘤等方面起重要作用，在胃癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中异常表达。
　　 通过应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，蛋白免疫印迹(Western blot)与免疫组织化学(immunohistochemistry)方法检测PLAG1、PLA2G2A在人正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中的表达情况，分析PLAG1及PLA2G2A在肝癌发生发展过程中的作用，旨在为肝癌早期诊断和分子靶向治疗找出理想的候选基因。
　　 材料与方法：
　　 正常肝组织19例，肝硬化组织15例，肝癌组织39例，均取自河南省人民医院2010年3月-2010年5月肝脏手术切除标本。正常肝组织乙肝表面抗原阴性，肝硬化、肝癌组织乙肝表面抗原均阳性，诊断均经病理证实。
　　 按照Simply P总RNA提取试剂盒操作步骤分别提取标本中总RNA，按RT-PCR试剂盒操作程序行逆转录聚合酶链式反应，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，并对PLAG1和PLA2G2A扩增产物进行扫描和半定量分析。
　　 Tricine-SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭后一抗孵育，二抗稀释液孵育，ECL化学发光显影。各组标本均常规HE染色，经病理学分级，运用SP法行免疫组织化学检测，用显微扫描成像系统拍照、储存图片。
　　 数据应用SPSS17.0统计软件进行成组设计资料的单因素方差分析后LSD-t检验、x2检验和Fisher's精确检验及Kruskal-Wallis秩和检验的统计学处理，以α=0.05为检验水准。
　　 结果：
　　 1．电泳结果证明已提取了高纯度的RNA，目的基因条带清晰，内参基因条带明亮。
　　 2．RT-PCR和Western blot实验表明：PLAG1mRNA和蛋白在肝癌中均呈上调表达，肝癌组、肝硬化组和正常组PLAG1 mRNA阳性表达率分别为：87.2％、46.7％和26.3％；三组间差异有统计学意义(x2=22.47，P(0.01)。PLAG1蛋白阳性表达率分别为：84.6％、40.0％和15.8％，三组间差异有统计学意义（x2=27.15，P＜0.01）。PLA2G2A mRNA和蛋白在肝癌中均呈下调表达，肝癌组、肝硬化组和正常组PLA2G2A mRNA阳性表达率分别为：28.2％，66.7％和89.5％；三组间差异有统计学意义（x2=20.83，P＜0.01）。PLA2G2A蛋白阳性表达率分别为：25.6％，73.3％和84.2％，三组间差异有统计学意义（x2=21.41，P＜0.01)。RT-PCR与Western blot结果一致。
　　 3．免疫组织化学实验结果表明：不同分化程度（x2=13.75，P＜0.01）和不同病理分级（x2=24.23，P＜0.01）的HCC组织PLAG1表达强度差异有统计学意义。肝癌组织分化程度越低，Edmondson分级程度越高，PLAG1表达程度越高。
　　 结论：
　　 1．在mRNA及蛋白水平上，PLAG1在肝癌组织中呈高程度的表达，说明PLAG1可能在肝癌形成的过程中起着非常重要的作用。PLA2G2A在肝癌组织中明显低表达，说明PLA2G2A的表达缺失可能与肝癌的发生发展有关。
　　 2． PLAG1表达强度与肝癌组织临床病理学特征有关，根据PLAG1的表达程度有助于对肝癌组织进行临床病理分级。
　　 3． PLAG1可能成为肝癌早期诊断的候选基因，PLA2G2A可能成为抗肿瘤的候选靶向药物。研究其异常表达的分子机制，有望能为肝癌提供一种潜在的分子靶向治疔途径。

目录

文摘

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中英文缩略词对照表

PLAG1和PLA2G2A在肝癌中异常表达的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

肝癌肿瘤标志物的研究现状

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢