柔红霉素联合硼替佐米对Raji细胞增殖、凋亡及bax基因表达的影响

摘要

目的:泛素-蛋白酶体通路(UPP)是真核细胞内蛋白质选择性降解的重要途径之一,参与细胞蛋白质的稳定和降解、基因表达调控、受体胞吞、应激反应及细胞凋亡等多种生理过程。硼替佐米为一种人工合成的硼酸肽类蛋白酶体抑制剂,其通过抑制细胞内蛋白质的降解,从而抑制NF-кB通路,促进P53和Bax蛋白的表达,促进P21、P27蛋白的蓄积,最终引起细胞凋亡。Bax蛋白是Bcl-2家族中一种重要的促凋亡蛋白。Bax蛋白通过BH3结构域与Bcl-2蛋白结合,而抑制其抗凋亡活性,同时Bax蛋白还可移位并插入到线粒体膜中,形成bax通道,从而促进细胞色素c释放入胞质,而诱导凋亡效应。本实验是研究硼替佐米联合一种常用的葸环类抗肿瘤药物柔红霉素,对人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞的增殖、凋亡及bax基因表达的影响。为其临床治疗Burkia淋巴瘤提供实验室数据。
　　 方法:
　　 1.药物对细胞的增殖抑制率:以台盼蓝拒染法进行活细胞计数,计算柔红霉素(浓度为0.1μg／ml、0.3μg／ml、O.5μg／ml、0.8μg／ml、1.0μg／ml)和硼替佐米(浓度为10ng／ml、50ng／ml、100nng／ml、300ng／ml、500nng／m1)对Raji细胞12h、24h、36h、48h、60h的增殖抑制率。对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米IC25组对Raji细胞12h、24h、36h、48h的抑制率。
　　 2.RT-PCR法检测bax mRNA的表达:对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米IC25组对Raji细胞作用48h后RT—PCR法测定bax mRNA表达的变化。
　　 3.免疫细胞化学法测定Bax蛋白表达:对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米ICE5组对Raji细胞作用48h后免疫细胞化学法测定细胞内Bax蛋白表达的变化。
　　 4.流式细胞术Annexin V／PI标记法测定凋亡:对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米IC25组对Raji细胞作用48h后流式细胞术测定细胞的凋亡情况。
　　 5.统计分析:所得数据应用SPSS17.0统计学软件处理,对计量资料,各组之间应用方差齐性检验和LSD-t检验；计数资料采用X2检验,各数据表达均用均数±标准差(x±s)表示。以α=0.01或α=0.05为检验水准,P<0.01或P<0.05为差异有显著性。
　　 结果:
　　 1.台盼蓝拒染法检测出浓度为0.1μg／ml、0.3μg／ml、0.5μg／ml、0.8μg／ml、1.0μg／ml的柔红霉素对Raji细胞48h的抑制率分别为(38.72±1.87)％,(48.64±1.65)％,(56.87±2.60)％,(66.38±2.55)％,(75.61±2.59)％,IC50=0.36μg／ml,IC25=0.06μg／ml。各浓度组均之间具有显著性差异。浓度为10ng／ml、50ng／ml、100ng／ml、300ng／ml、500ng／ml的硼替佐米对Raji细胞48h的抑制率分别为(5.62±1.86)％,(20.23±0.97)％,(29.01±1.78)％,(72.65±2.45)％,(86.42±2.18)％,IC50=23.6ng／ml,IC25=8.5 ng／ml。各浓度组均之间具有显著性差异。对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米IC25组对gaji细胞48h增殖抑制率为(2.02±1.06)％,(48.63±2.13)％,(52.32±1.66)％,(76.87±2.67)％,加药组与对照组均有显著性差异,联合用药组与两个单药组之间均有显著差异。
　　 2.对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米IC25组对Raji细胞作用48h后,bax mRNA经RT-PCR扩增后电泳DNA条带灰度值比值分别为0.554±0.012,0.738+0.023,1.138±0.064,2.384±0.096,各组之间均有统计学差异。
　　 3.对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米IC25组对Raji细胞作用48h后,Bax蛋白经免疫细胞化学染色后,阳性率分别为7.68±1.65、66.54±1.79、72.39±1.95、96.57±2.28,积分分别为12.71±5.74、76.97±25.12、106.78±31.64、172.07±38.54,各组之间阳性率和积分均有统计学差异。
　　 4.流式细胞术Annexin V／PI标记法测定对照组、柔红霉素IC50组、硼替佐米IC50组、柔红霉素IC25联合硼替佐米IC25组对Raji细胞作用48h后,各组凋亡率分别为(1.23±0.29)％,(38.52±4.23)％,(67.37±3.62)％,(81.63±5.19)％,各组之间均具有统计学差异。
　　 结论:
　　 1.柔红霉素和硼替佐米能够抑制Raji细胞增殖,抑制作用呈时间和浓度依赖性,两药联合应用能起到协同抑制效应。
　　 2.硼替佐米和柔红霉素能够诱导Raji细胞Bax mRNA和蛋白的表达增多,硼替佐米效果强于柔红霉素,两药联合应用起协同效应。
　　 3.柔红霉素联合硼替佐米作用于Raji细胞,其凋亡效应明显强于单独用药。