SIgMλ轻链的基因沉默对IBDV结合DT40细胞的影响

摘要

鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡的传染性法氏囊病毒(IBDV)引起的传染性免疫疾病。鸡的法氏囊是该病毒侵染的靶器官，主要是膜表面可以表达SIgM的法氏囊前B淋巴细胞。研究表明，SIgMλ轻链是IBDV感染法氏囊细胞时的一个重要结合位点。但SIgMλ轻链基因在IBDV感染鸡法氏囊细胞的过程中的分子机制还需要进一步的探究。
　　 为了深入研究SIgMλ轻链基因在IBDV感染鸡法氏囊细胞中的基因功能，本研究利用RNAi技术设计了一个可以特异性抑制SIgMλ轻链基因表达的表达载体pAnGH1—shCRL。将该载体转染DF—1细胞和DT40细胞，利用流式细胞术和RT—PCR等技术鉴定了SIgMλ轻链基因的表达情况；并利用病毒感染实验鉴定了IBDV感染表达pAnGH1—shCRL基因序列的DT40细胞的情况。
　　 为了构建可以在细胞内特异性抑制SIgMλ轻链基因表达的RNAi载体，在分析了SIgMλ轻链的基因序列后，以pCDNA3．1(+)载体为骨架，将SV40启动子改变为鸡源的β—actin启动子形成用于驱动新霉素抗性基因(Neomycin)表达；同时装入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达框以及用于启动shRNA转录的H1启动子，构建了一个具有EGFP绿色荧光标记和新霉素抗性，同时可以靶向干扰SIgMλ轻链基因表达的共表达载体pAnGH1—shCRL。该载体不仅可以用来标记和追踪被转染的阳性细胞，而且还可以用于持续转录shRNA的基因沉默稳定细胞系的筛选。
　　 流式细胞术、RT—PCR等结果显示：同对照组细胞相比，转染pAnGH1—shCRL载体的DT40细胞与SIgMλ轻链的特异性单抗L1的结合明显下降，SIgMλ轻链基因的表达受到抑制，并且该细胞与IBDV的结合率也明显降低。这说明pAnGH1—shCRL表达载体可以在DT40细胞内特异性的干扰SIgMλ轻链基因的表达。利用pAnGH1—shCRL表达载体稳定转染DT40细胞，在G4．18抗性培养基中进行筛选并利用有限稀释法挑取单克隆，对其进行扩大培养和功能性鉴定，实验结果显示得到的单克隆细胞经过多次的传代后，pAnGH1—shCRL载体仍然能够持续表达并对SIgMλ轻链基因的表达进行特异性的抑制。结果表明构建的pAnGH1—shCRL共表达载体的RNAi效果是高效的。
　　 本实验利用RNAi技术成功获得了SIgMλ轻链基因持续沉默的单克隆细胞株，通过实验进一步证实了SIgMλ轻链是IBDV与DT40细胞的一个重要结合位点，SIgM九轻链基因的表达与否可以影响IBDV与DT40细胞的结合能力。这为进一步探索IBDV感染法氏囊细胞的分子机制及感染过程奠定了基础，也为鸡传染性法氏囊病的预防、控制和治疗提供了理论支持。