HIV-1反转录酶的表达、纯化、结晶与功能研究

摘要

获得性免疫缺陷综合症即艾滋病(Acquried immunodeficiency syndrome,AIDS),是人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)诱发引起的。HIV是一种逆转录病毒,分为HIV-1和HIV-2两种类型。HIV-1逆转录酶(reverse transcriptase,RT)在病毒生命周期中起重要作用。病毒进入宿主细胞胞之后,通过逆转录酶将单链RNA反转录为双链DNA,随后病毒DNA在整合酶的作用下,整合到宿主DNA中,完成转录、翻译等整个生命周期。
　　 在HIV—1病毒的复制过程中,快速复制和易出错的特点使病毒在感染者体内可以快速地演化,导致HIV-1疫苗的研发和药物治疗具有很大的挑战性。到目前为止,抗HIV-1药物在临床治疗中已经取得很大的成功,延迟病人生命总时间超过三百万年。不幸的是,HIV-1可以对几乎所有的可使用的药物产生抗药性。虽然一些效果较好的抗HIV-1药物已经被认可并被用于临床治疗,但是,这些药物的细胞毒性和病毒的耐药性要求我们必须研发更有效药物。逆转录病毒复制过程中的三个关键酶:逆转录酶、整合酶和蛋白酶,都是很好的药物靶点。两种不同类型的逆转录酶抑制剂:核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂,都可以抑制逆转录酶的聚合酶活性,都被用于治疗HIV-1感染,同时还有一类比较有研究前景的化合物,它们可以抑制核酸水解酶(RNase H)活性,或者通过其它方式抑制聚合酶活性。
　　 为了研究开发更有效的HIV-1逆转录酶抑制剂,我们设计了一系列的小分子抑制剂,包括NNRTIs和NRTIs,通过化学合成的方法,合成这些小分子抑制剂。并通过分子生物学实验方法,构建HIV-1 RT的表达载体,大量表达纯化出高纯度的RT蛋白,用于生物化学实验和结晶实验。通过一系列的生化实验,我们验证了所纯化的HIV-1 RT蛋白与双链DNA、单链DNA和HIV-1整合酶(IN)的相互作用,以及HIV-1蛋白水解酶对HIV-1 RT的P66亚基的有限水解活性。我们得到了HIV-1RT蛋白的晶体,经过一系列的优化,利用X-光衍射射线晶体学技术最终获得衍射能力达到2.1(A)的高分辨率的RT蛋白晶体。但是抑制剂与RT的共结晶实验以失败告终,我们没有得到结合有我们所设计的抑制剂的复合物晶体,但是我们的结晶实验为研究开发更有效的HIV-1的RT的抑制剂提供便利的研究平台。