白藜芦醇对糖尿病大鼠肾脏叉头转录因子01的影响及机制研究

摘要

背景与目的：
　　 糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病微血管并发症之一,是引起终末期肾功能衰竭的主要因素。目前其发生机制尚不完全清楚。近年来大量研究表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)是糖尿病血管并发症及糖尿病本身发生发展的一个主要因素,其与DN的关系尤为密切[1]。叉头状转录因子Ol(Forkhead transcription factor Ol,FoxOl)是Fox蛋白家族中的一员,其可通过上调抗氧化靶基因的水平,如,过氧化氢酶(catalase,CAT),起到抗氧化应激的作用[2]。
　　 沉默信息调节因子2(Sir2,哺乳动物为Sirtl)是细胞应激时FoxO乙酰化和转录功能的重要调节子[3]。Sirtl／FoxOl通路对糖尿病肾病发生发展的影响国内外尚无报道,此通路对糖尿病肾脏是否起保护作用有待探讨。白藜芦醇(resveratrol,Res)是目前发现的最强的Sirtl激活剂[4],其可使Sirtl的表达增加。本实验应用白藜芦醇治疗实验性糖尿病大鼠,探讨白藜芦醇／Sirtl／FoxOl／CAT通路对糖尿病大鼠肾脏的保护作用,进一步研究DN发生发展的机制。
　　 材料与方法：
　　 健康、雄性清洁级SD大鼠42只,体重(220±20)g,随机选取32只大鼠建立糖尿病(DM)模型,其余10只大鼠作为正常对照组(A组)。DM大鼠造模方法如下:禁食12h后,按60mg／kg一次性大剂量腹腔注射1％STZ溶液,A组注射相当体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。72h后测定血糖(BG)≥16.7mmol／L,为DM成模标准(4只失败)。将糖尿病鼠再随机分为糖尿病未治疗组(B组)和糖尿病白藜芦醇治疗组(C组)。自成模之日起,C组每日固定时间以白藜芦醇混悬液30mg／kg,1次／日,灌胃12周。A、B组给予相同剂量的生理盐水。各组大鼠自由进食饮水,实验中不予任何降血糖药物。实验第12周末,代谢笼收集24小时尿,离心,保存于4℃冰箱,测定24小时尿蛋白(UPro／24h)及尿白蛋白定量(UAIb)。麻醉后腹腔静脉取血,分离血清检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。剥离双肾,右肾称重后取肾皮质置于4％多聚甲醛中固定,光镜观察肾小球病理学变化,免疫组化检测大鼠肾小球胶原Ⅳ、纤连蛋白表达水平；取左肾上极1mm3大小的组织块,迅速用4％冷戊二醛溶液固定,透射电子显微镜观察肾脏超微结构变化,剩余肾皮质迅速置于-70℃冰箱里,分光光度计检测肾皮质丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)活性,RT-PCR检测肾皮质沉默信息调节因子1(Sirtl)、FoxOl、过氧化氢酶(CAT)mRNA表达水平,Western blot检测FoxOl蛋白及其磷酸化的表达。
　　 结果：
　　 1.实验12周末,与正常对照组比较,糖尿病未治疗组BG(28.2±2.7)mmol／L、KI(8.1±0.8)×10-3、UPro／24h(26.8±4.1)mg／24h、UAIb(0.89±0.13)mg／24h、Scr(73.5±10.9)μmol／L和BUN(15.3±1.4)mmol／L水平显著升高(均P<0.05),BW(250±27)g水平明显降低(P<0.05)；与糖尿病未治疗组比较,白藜芦醇治疗组KI(5.2±0.5)×10-3、Upro／24h(16.9±2.6)mg／24h、UAIb(0.65±0.11)mg／24h、Ser(56.7±5.9)μmol／L和BUN(11.3±1.1)mmol／L水平明显降低(均P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05),BG(27.8±3.3)mmol／L水平稍有下降、BW(271±31)g水平稍有上升,但差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 2.糖尿病未治疗组肾皮质MDA含量(3.47±0.24)nmol／mg prot比正常对照组(1.35±0.29)nmol／mg prot明显升高(P<0.05),肾皮质总SOD活性(23.51±7.79)U／mg prot较正常对照组(65.74±8.71)U／mg prot显著降低(P<0.05)；与糖尿病未治疗组相比,白藜芦醇治疗组肾皮质MDA含量(2.48±0.27)nmol／mg prot显著减少(P<0.05),总SOD活性(43.31±5.57)U／mg prot则明显升高(P<0.05)。
　　 3.免疫组化结果显示,与正常对照组比较(分别为1.09±0.11,1.81±0.44),糖尿病未治疗组大鼠肾小球纤连蛋白(10.65±1.27)、胶原Ⅳ(20.11±1.28))表达水平升高(均P<0.05)；白藜芦醇治疗组大鼠肾小球中两者蛋白的表达水平(分别为6.26±1.04,10.08±1.01)较糖尿病未治疗组均明显降低(均 P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05)。
　　 4.糖尿病未治疗组大鼠肾皮质Sirtl(0.63±0.04)、FoxOl(0.37±0.03)、CATmRNA(0.22±0.03)表达水平较正常对照组明显降低(分别为0.96±0.08,0.69±0.05,0.48±0.04:均P<0.05)；与糖尿病未治疗组比较,白藜芦醇治疗组糖尿病大鼠肾皮质三者的mRNA的表达水平显著增加(分别为0.83±0.05,0.53±0.04,0.40±0.03；均P<0.05),但仍高于正常对照组(P<0.05)。
　　 5.糖尿病未治疗组FoxOl磷酸化水平(2.15±0.08)较对照组(1.14±0.08)明显升高,白藜芦醇治疗组FoxOl磷酸化水平(1.72±0.07)较糖尿病未治疗组显著降低(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)；FoxOl蛋白表达各组间比较无显著性差异(分别为0.45±0.09,0.48±0.08,0.47±0.09:均P>0.05)。
　　 6.肾脏病理检测显示,光镜HE染色显示正常对照组大鼠肾小球结构未见异常,糖尿病未治疗组大鼠肾小球体积增大,系膜细胞增生,肾小球系膜基质增多,基底膜增厚。电镜超微结构显示正常对照组大鼠肾小球结构清晰,基底膜均匀无增厚,上皮细胞足突均匀分布,糖尿病未治疗组大鼠肾小球基底膜显著增厚,厚薄不均,上皮细胞足突融合。白藜芦醇治疗组大鼠肾小球病理变化明显改善,表现为系膜细胞增生程度降低,肾小球基底膜增厚程度减轻,足突融合减轻。
　　 结论：
　　 1.糖尿病大鼠肾脏中FoxOl mRNA水平降低,FoxOl蛋白磷酸化水平升高。糖尿病大鼠肾脏中FoxOl的抗氧化应激作用降低。
　　 2.白藜芦醇增加糖尿病大鼠肾脏FoxOl mRNA表达,降低FoxOl蛋白磷酸化水平。
　　 3.白藜芦醇可能通过增加Sirtl的表达使FoxOl的表达及活性增加,继而FoxOl上调其抗氧化靶基因CAT的表达,降低肾脏氧化应激反应,减缓或抑制DN的发生。
　　 4.对Sirtl／FoxOl通路的调节可能成为预防和治疗DN的潜在治疗靶点。