JNK/c-Jun通路及其靶基因Bim与PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中的实验研究

摘要

1.前言:
　　 先天性或后天性因素引起的晶状体混浊即为白内障。白内障是目前最常见的致盲和视力残疾的原因之一。白内障的发病机制迄今尚未完全揭示，为了寻求有效的药物疗法，白内障的病因研究已成为眼科研究热点之一。
　　 已知多种因素均可诱导白内障的发生，目前认为氧化应激是诱导白内障发生的最初因素。近来对白内障发病机制的研究主要集中在细胞和分子生物学水平。晶状体上皮细胞可以维持整个晶状体的透明性，保持其内环境的稳定，且晶状体上皮细胞的凋亡被认为是除了先天性白内障以外所有类型的白内障发生的细胞学基础，因此防治原发性或后发性白内障的研究重点是如何调控晶状体上皮细胞的凋亡。
　　 PUMA、Bim是Bcl-2蛋白家族BH3-only亚家族中重要的促凋亡基因，在多种因素诱导的细胞凋亡启动和多种疾病的发生过程中都发挥着重要的作用。目前尚没有PUMA、Bim在过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞系HLEC-B3凋亡中作用的相关报道，探讨PUMA、Bim对人晶状体上皮细胞凋亡的作用及其诱导表达的途径和机制，进一步阐明白内障发病机制，可以为基因治疗提供前期的理论依据。
　　 JNK信号通路参与了多种生理和病理过程，激活后的JNK能激活包括转录因子在内的多种效应蛋白，产生生物学效应。C-jun是JNK的主要下游因子，编码的蛋白产物可以构成转录因子AP-1，转录因子AP-1是细胞内JNK/SAPK作用的重要目标。在活化条件下，JNK磷酸化c-jun，并增加其转录活性，c-jun蛋白可以根据不同的细胞类型决定诱导细胞凋亡或者抑制细胞凋亡。有关氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中JNK/c-jun通路的变化尚无报道。
　　 在不同的细胞中，PUMA、Bim的表达有不同的调节方式，如转录水平、翻译后修饰和蛋白水平的调控等。Bim还可受到多种信号通路的调节，如PI3K/Akt、MLK/JNK、RAS/MAPK等。
　　 在晶状体上皮细胞的凋亡过程中，氧化应激是通过什么途径介导PUMA、Bim的表达上调，目前尚不清楚，进一步了解介导途径，通过抑制特定转录因子的活性从而抑制PUMA、Bim的表达可能会成为白内障治疗的一种新途径。
　　 2.目的:
　　 研究Bim、PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞系HLEC-B3凋亡中的作用;探讨JNK/c-Jun信号通路的激活与其靶基因Bim、PUMA在氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞系HLEC-B3凋亡中上调的关系，从而进一步阐明人晶状体上皮细胞凋亡的分子生物学机制。
　　 3.方法:
　　 3.1细胞的培养:贴壁HLEC-B3细胞在37℃、5％二氧化碳孵育箱、含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，2～3d以1(∶)2传代1次;
　　 3.2细胞凋亡的检测:过氧化氢刺激体外培养的人晶状体上皮细胞，Hoechst33258染色观察细胞形态，凋亡细胞呈现典型的细胞核致密浓染或碎块状致密浓染，计数细胞凋亡率;
　　 3.3WesternBlot:采用westernblot方法检测Caspase-3及JNK是否激活，观察c-Jun、Bim及PUMA蛋白水平;
　　 3.4RT-PCR:采用RT-PCR方法检测c-Jun、Bim、PUMAmRNA表达水平;
　　 3.5小分子干扰:采用JNK/c-Jun通路抑制剂CEP14004及SP600125观察能否保护氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡，采用小分子干扰片段敲除Bim、PUMA，观察能否保护氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡。
　　 4.结果:
　　 4.1氧化应激诱导人晶状体上皮细胞HLEC-B3凋亡
　　 采用50μmol/LH2O2处理晶状体上皮细胞4h、8h、12h后，分别引起约4.30％±1.15％、27.08％±0.74％、46.59％±0.91％细胞凋亡，与无H2O2处理组(2.74％±0.21％)相比差异有统计学意义。凋亡相关的关键蛋白Caspase-3发生时间依赖的表达上调。以上结果充分表明:氧化应激能诱导人晶状体上皮细胞发生典型的凋亡。
　　 4.2氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞HLEC-B3凋亡中，JNK/c-Jun通路激活，Bim及PUMA表达上调
　　 H2O2处理2小时JNK磷酸化水平就显著升高，并在后续的检测时间点持续增加，而JNK蛋白质总量保持一致，说明JNK被激活。激活后的JNK磷酸化下游底物c-Jun，使c-Jun转录活性增加。c-Jun磷酸化水平在H2O2处理2小时后显著增加，与JNK磷酸化变化趋势基本一致。这一结果表明氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞HLEC-B3凋亡过程中JNK/c-Jun通路激活。
　　 伴随着细胞凋亡的发生，Bim及PUMA蛋白在4h开始发生显著上调，早于显著凋亡形态发生的时间点(8h)，进一步采用RT-PCR手段检测后发现Bim及PUMAmRNA在2h已有显著上调。以上结果表明，氧化应激在诱导HLEC-B3凋亡的同时，同时也诱导了促凋亡关键蛋白Bim及PUMA转录依赖的上调。
　　 4.3过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡过程中，JNK/c-Jun介导了Bim及PUMA上调
　　 H2O2处理的人晶状体上皮细胞中加入JNK/c-Jun信号通路抑制剂CEP11004或SP600125处理4小时后WB检测，以无H2O2或H2O2+DMSO处理的细胞分别作为阴性对照和阳性对照，结果发现，CEP11004及SP600125可完全抑制H2O2引起的c-Jun蛋白水平增加，说明CEP11004及SP600125阻断了JNK活性。同时发现Bim及PUMA的表达上调可被CEP11004及SP60012明显抑制。我们的结果表明JNK介导了Bim及PUMA的表达上调。同时我们发现，JNK通路抑制剂能明显降低H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡(12h)，使凋亡率由43.49％±1.05％降低为13.29％±0.57％(CEP11004)及15.89％±1.03％(SP600125)。
　　 4.4小分子干扰Bim及PUMA保护过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡
　　 首先我们验证了小分子干扰片段的有效性。当细胞融合度为60％时，转染Bim或PUMA小分子干扰片段，24h后用H2O2处理细胞，处理细胞后8h收蛋白，用westernblot检测Bim及PUMA的表达情况，结果表明，Bim及PUMA的小分子干扰片段分别有效抑制了氧化应激诱导的Bim及PUMA蛋白质表达上调。在验证了小分子干扰片段的有效性后，我们在敲除Bim或PUMA表达的基础上观察H2O2诱导HLEC-B3凋亡的情况。H2O2处理HLEC-B312h后引起约47.70％±0.42％细胞发生凋亡，而敲除Bim的表达后细胞凋亡率显著降低，降为25.50％±1.02％(siBim1)及30.39％±0.62％(siBim2);相似的干扰PUMA也能明显降低人晶状体上皮细胞凋亡，由44.50％±0.63％降为20.51％±0.78％(siPUMA1)及23.23％±0.58％(siPUMA2)。以上结果表明敲除Bim或PUMA的表达对HLEC-B3有一定的保护作用，Bim及PUMA参与了氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡。
　　 5.结论:
　　 过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中，PUMA、Bim的表达上调，JNK/c-Jun介导过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中PUMA、Bim的上调。JNK/c-Jun介导的Bim及PUMA上调参与了过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡，可能在白内障的发生发展中发挥重要作用。此研究更深入的探讨了人晶状体上皮细胞的凋亡机制，为白内障的发病机制和白内障的防治提供更多的理论依据。

目录

声明

摘要

一、英文缩略词

二、引言

三、材料和方法

3．1 材料

3．2 方法

3．3 统计学方法

四、结果

4．1 Bim介导氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡

4．2 PUMA介导氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡

4．3 JNK／c-Jun通路介导氧化应激诱导的晶状体上皮细胞凋亡中Bim和PUMA的上调

五、讨论

5．1 氧化应激诱导人晶状体上皮细胞发生典型凋亡

5．2 氧化应激诱导人晶状体上皮细胞凋亡中Bim、PUMA表达上调

5．3 JNK／c-Jun介导的Bim及PUMA上调参与了过氧化氢诱导的人晶状体上皮细胞凋亡

六、结论

本文创新点的自我评价

参考文献

综述

附录

一 个人简历

二 基金资助

致谢