铂类药物耐药卵巢癌细胞系中Annexin A3与TAp73蛋白相互作用的研究

摘要

背景和目的
　　 卵巢癌发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中占第3位,却是女性生殖器官恶性肿瘤中首位的致死性疾病,临床医师已经把卵巢癌归类到“沉默杀手”之列。68％的病例被诊断时已经是晚期,五年生存率低于45%。诊断后对原发瘤的第一次手术治疗辅以铂类联合紫杉醇的化疗是卵巢癌治疗中最重要的步骤,但耐药的发生使超过80%的病人经历早期复发,铂类药物的耐药是卵巢癌治疗中的一个最主要的障碍。因耐药机制有多因素、多途径、多层次的特点,目前尚未达成共识。基因组学的研究开辟了蛋白质组学的新篇章,蛋白质问有序的相互作用参与调控细胞间和细胞内的信号转导。酵母双杂交技术是功能蛋白质组学技术之一,是在真核模式生物酵母中进行的研究活细胞内蛋白质相互作用的技术。
　　 Annexin A3是Annexin家族中唯一具有酶活性的成员,具有抑制磷脂酶A2和抗凝的功能,并在控制细胞增殖方面发挥作用。新的研究发现Annexin A3蛋白在卵巢癌铂类耐药细胞株中的表达明显升高,同时在mRNA和蛋白质的表达水平得到验证。在进一步的临床标本验证中检测发现,Annexin A3在临床卵巢癌铂类耐药患者的组织中表达明显升高,且Annexin A3高表达组的无瘤生存期显著缩短。此外,Annexin A3高表达的细胞对铂类药物的耐药性明显增强,但与紫杉醇、表阿霉素等药物无交叉耐药性,提示Annexin A3蛋白可能成为卵巢癌特异性的铂类耐药相关蛋白。
　　 p73基因是Kaghad等于1997年在对COS细胞cDNA库中进行杂交筛选时偶然发现的一个假阳性的cDNA克隆,表达两类功能对立但是互相制约的多种异构体:一类是羧基末端异构体(TAp73);另一类是氨基末端异构体(△Np73)。TAp73是有转录激活能力的p73蛋白,能上调p53的靶基因,导致细胞生长抑制,抑制细胞增殖周期,诱导凋亡,使肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性增加。氨基末端异构体(△Np73)的表达会导致肿瘤细胞对化疗耐药。
　　 本研究应用酵母双杂交系统检测在铂类耐药卵巢癌细胞系COC1/DDP中Annexin A3蛋白与TAp73蛋白的相互作用。
　　 方法
　　 应用RT-PCR的方法扩增铂类耐药卵巢癌细胞系COC1/DDP中Annexin A3与TAp73基因CDS编码序列,经蓝白斑筛选测序无误后与pGBKT7和pGADT7质粒载体相连,构建pGBKT7-Annexin A3和pGADT7-TAp73重组载体,分别转化Y2HGold和Y187酵母菌株,检测融合蛋白对菌株无毒性和自激活后,将两类转化酵母进行性融合,通过SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/Aba筛选得到pGBKT7-Annexin A3和pGADT7-TAp73的阳性克隆,鉴定pGBKT7-Annexin A3和pGADT7-TAp73两重组质粒是否具有相互作用。
　　 结果
　　 成功扩增了铂类耐药卵巢癌细胞系COC1/DDP中Annexin A3与TAp73基因CDS编码序列,经蓝白斑筛选、酶切及测序无误,成功构建pGBKT7-AnnexinA3和pGADT7-TAp73重组载体,检测融合蛋白对菌株无毒性和自激活作用,通过SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/Aba筛选得到了pGBKT7-Annexin A3和pGADT7-TAp73的阳性克隆,鉴定了pGBKT7-Annexin A3和pGADT7-TAp73两重组质粒具有相互作用。
　　 结论
　　 本实验成功构建了pGBKT7-Annexin A3和pGADT7-TAp73载体和能稳定表达pGBKT7-Annexin A3和pGADT7-TAp73融合蛋白的酵母菌株。通过酵母双杂交技术鉴定了在铂类药物耐药卵巢癌细胞系中COC1/DDP中AnnexinA3蛋白与TAp73蛋白之间确有相互作用。