CDK抑制剂夫拉平度诱导人骨肉瘤MG63细胞凋亡和分化的研究

摘要

研究背景:
　　 骨肉瘤(Osteosarcoma)是一种恶性程度很高的肿瘤,根据不同分级骨肉瘤细胞的生物学特征推测,骨肉瘤的发生可能起源于骨髓基质干细胞向成骨细胞分化以及成骨细胞终末分化的过程中。成骨细胞的终末分化是一个精密协调的过程,需要关键的成骨特异性转录因子Runx2(cbfa)与Rb蛋白协调共同介导整个过程。通常低磷酸化的Rb蛋白通过限制细胞合成S期相关的蛋白质而阻止细胞进入S期,Runx2通过识别成骨细胞特异性顺式作用元件(OSE)而启动成骨细胞分化相关基因的转录,继而促进成骨细胞的分化。恶性肿瘤的主要生物学行为是细胞周期脱调控,即无限增殖,这一过程需要周期蛋白激酶(CDK)和周期蛋白(Cyclin)作为主要的分子基础共同来执行。骨肉瘤中CDK-Cyclin复合物往往处于过表达或失去正常调控机制的状态,且CDK4等周期蛋白激酶可同时介导Runx2蛋白的泛素化降解和Rb蛋白的磷酸化。因此,通过抑制CDK活性而恢复Runx2等细胞分化的关键蛋白活性和生理状态将对逆转骨肉瘤的恶性表型使其向终末分化方向发展是非常有利的,并可能导致肿瘤细胞周期阻滞和凋亡。
　　 研究目的:
　　 本课题拟以人骨肉瘤细胞系MG63为实验对象,观察不同浓度的CDK抑制剂盐酸夫拉平度(Flavopiridol,FP)对MG63细胞增殖活力的影响及通诱导细胞凋亡的作用机制;同时观察低浓度FP对细胞分化的诱导作用及可能的机制。
　　 方法:
　　 1.采用噻唑蓝(MTT)比色法检测浓度为0nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nm、1000nm和2000nM的FP对细胞增殖的影响。
　　 2.FCM PI单荧光标记检测浓度为0nM、200nM和400nM的FP干预24h、48h和72h,细胞周期的变化。
　　 3.FCM Annexin V/PI双荧光标记检测浓度为0nM、200nM和400nM的FP作用24h和48h,细胞早期凋亡情况。
　　 4.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测浓度为0nM、200nm、400nM和2000nM的FP干预后,细胞凋亡相关基因表达量的变化;检测0nM、100nM、200nM和300nM的FP干预后,细胞分化相关基因的表达量的变化。
　　 5.磷酸苯二钠法测定浓度为0nM、100nM、200nM和300nM的FP干预后,细胞内碱性磷酸酶(ALP)活力的改变。
　　 6.微量酶联免疫法(ELISA)测定浓度为0nM、100nM、200nM和300nM的FP干预后,Ⅰ型胶原表达量的变化。
　　 7.Western Blotting检测浓度为0nM、100nM、200nM和300nM的FP干预后,细胞内CDK2和Runx2蛋白的表达。
　　 结果:
　　 1.MTT结果显示,200nM～2000nM浓度范围内的FP对细胞活性均有明显抑制作用,其中200nM～400nM浓度区间呈线性增强;整体范围内24h、48h和72h细胞抑制率呈上升趋势,相应的IC50约为24h:580nM、48h:390nm、72h:260nM。
　　 2.PI单荧光流式细胞术检测结果显示,200nM与400nM浓度组的FP干预24h、48h和72h均可引起MG63细胞G2期明显阻滞,两浓度组相应S期比例较对照组明显下降(P＜0.01),G2期较对照组显著上升(P＜0.01)。
　　 3.AnnexinV/PI双荧光流式细胞术检测结果显示g24h各组早期凋亡率分别是,对照组为0.96±0.08％、200nM为17.29±1.15%、400nM为24.39±2.74%,单因素方差分析结果显示3组早期凋亡率有差异(F=147.258,P=0.000),多重比较结果显示:400nM组作用强于200nM组强于对照组,提示24h的FP具有诱导MG63细胞凋亡的作用,并在一定范围内浓度越大诱导凋亡作用越强。48h时对照组、200nM组、400nM组早期凋亡率分别是0.55±0.10%、24.91±5.09%、20.21±1.96%。单变量方差分析结果示:3组早期凋亡率有差异(F=50.519,P=0.000),400nM与200nM相比对照组均有差异,但400nM与200nM间无明显差异。
　　 4.ALP活性测定结果显示:对照组、100nM、200nM和300nM浓度组处理后细胞后,ALP活性在1d～12d内均缓慢上升,其活性峰值时间出现在第12d,随后开始下降。3组活性均高于对照组(P＜0.05),300nM组高于100nM与200nM组(P＜0.05)。
　　 5.Ⅰ型胶原检测结果显示:200nM和300nM的FP作用24d,与对照组比较可Ⅰ型胶原表达量上升(P＜0.05),其中300nM组较100nM与200nM组上调作用明显(P＜0.05)。
　　 6.RT-PCR灰度扫描结果显示:与对照组比较2000nM的FP可明显降低CDK2、CDK4、P27KIP1、P21WAF、Survivin及Rb的mRNA转录水平(P＜0.05),明显上调Runx2和骨钙素(OCN)的mRNA表达量(P＜0.05)。
　　 7.Western Blotting结果显示:100nM、200nM和300nM的FP作用于细胞10d可明显降低细胞内CDK2蛋白表达量(P＜0.02)上调Runx2蛋白表达量(P＜0.01)。
　　 结论:
　　 1.FP能有效的抑制MG63细胞的增殖,且呈浓度、时间依赖性,并可引起细胞G2期阻滞,其中400nM浓度组作用明显并诱导细胞凋亡。
　　 2.FP可下调细胞周期相关蛋白基因CDK2、CDK4、P27KIP1,P21WAF、Survivin、Rb的mRNA表达水平,且降低CDK2蛋白表达量。
　　 3.低浓度FP(100nM～300nM)可以诱导成骨特异性标志物ALP活性上升、Ⅰ型胶原、OCN表达增强t上调成骨转录因子Runx2的mRNA及蛋白的表达量。