siRNA沉默CIP2A基因对人类肝癌细胞HepG2增殖影响

摘要

目的：CIP2A是蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子。用KNA干扰技术使人肝癌细胞HepG2细胞中的CIP2A基因沉默不表达。设计出了五个CIP2A基因的干扰片段,另外设计一个不含干扰片段的plko-control组,从中筛选出一个沉默效率最佳的干扰片段。将筛选出的最佳干扰片段稳定转染入HepG2细胞中并用嘌呤霉素筛选以获得稳定表达细胞株。利用Western blot、RT-PCR和MTT等实验方法以探索CIP2A基因对人肝癌细胞HepG2细胞的生物学效应以及与CIP2A基因与c-Myc基因的相互关系。
　　 方法：⑴将带干扰片段的质粒转化入感受态细胞大肠杆菌DH5a,提取质粒,通过双酶切鉴定和测序确定干扰片段的正确性。⑵将带干扰片段的质粒用Lipofectamine2000转染入人肝癌细胞HepG2细胞中,用Western blot和RT-PCR技术从五条干扰片段中筛选出一条沉默CIP2A基因最佳的序列。⑶确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度:确定出嘌呤霉素用于筛选稳定表达细胞株的最佳浓度。⑷获得稳定表达的细胞株:将能沉默CIP2A基因的最佳干扰质粒稳定转染入人肝癌细胞HepG2细胞中,用嘌呤霉素筛选以获得稳定表达细胞株。⑸CIP2A基因沉默后对c-Myc基因的影响:用Westem blot和RT-PCR检测CIP2A基因沉默之后c-Myc蛋白的表达情况和c-Myc mRNA的表达情况。⑹CIP2A基因沉默后对人肝癌细胞HepG2细胞的生物学影响:用MTT法检测CIP2A基因沉默之后对人肝癌细胞HepG2细胞生长情况的影响。
　　 结果：质粒转化大肠杆菌之后所提质粒经酶切鉴定和测序鉴定后均为带目的干扰片段的质粒。瞬时转染之后检测瞬时转染细胞中CIP2A蛋白和mRNA的表达情况,得到沉默CIP2A基因最佳的序列为plko-1.2。将plko.1-2转染入HepG2细胞用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株,RT-PCR结果显示:plko.1-2组中CIP2A基因的mRNA的表达分别与空白对照组和plko.1-control组相比差异均有统计学意义(P＜0.01)且显著降低:plko.1-2组中c-Myc基因mRNA的表达分别与空白对照组和plko.1-control组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。Western blot检测结果显示:plko.1-2组中CIP2A蛋白的表达分别与空白对照组和plko.1-control组相比差异均有统计学意义(P＜0.01)且显著降低;plko.1-2组中coMyc蛋白的表达分别与空白对照组和plko.1-control组相比差异均有统计学意义(P＜0.01)且显著降低;MTT检测结果显示:siRNA沉默CIP2A基因之后,细胞的增殖能力减弱。
　　 结论：将带干扰片段的质粒转化入感受态细胞大肠杆菌DH5a,提取质粒,通过双酶切鉴定和测序确定干扰片段的正确性。最佳沉默效率的质粒为plko.1-2,将其稳定转染入HepG2细胞中,结果显示:CIP2A基因是在转录后水平上影响c-Myc基因的表达;CIP2A基因的抑制能够抑制肿瘤细胞的生长。CIP2A基因有可能成为治疗肝癌的新靶点。