siRNA沉默Livin基因表达对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

摘要

背景与目的:肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，该疾病发病率的趋势逐年增高，手术切除仍然是治疗肝癌最有效的方法。许多基因的参与与肝癌的发生发展及转归有着密切的关联，在肝癌的不同发展时期均有基因的参与及调控。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是存在于真核生物体内的一种阻断外源基因表达的自我防御体系。由双链RNA介导，能够特异性的使细胞内与其互补的单链RNA发生降解。近年来，国内外报道了一系列通过RNAi特异性抑制肝癌发病相关基因的实验，为肝癌研究及靶向治疗带来新希望和新启示。Livin又称KIAP(kidneyinhibitor of apoptosis protein)、ML-IAP(melanoma inhibitor of apoptosis protein),是新近发现的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的新成员，最近研究表明，Livin基因在多种肿瘤细胞中高表达，参与肿瘤的发生发展。本研究通过RNA干扰技术抑制肝癌细胞株HepG2中Livin基因的表达，观察Livin基因对肝癌细胞HepG2的增殖、凋亡以及细胞周期的影响，并探讨其相关作用机制，为以Livin基因为靶点肝癌的基因治疗提供实验依据。
　　 方法:将携带Livin基因的siRNA载体转染至HepG2细胞内，应用RT-PCR、Western blot技术检测转染前后Livin基因mRNA和蛋白质的表达改变。流式细胞技术(FCM)和TUNEL检测转染前后肝癌细胞周期与凋亡的变化。采用SPSS15.0统计学软件进行统计学实验结果分析，以(x)±s来表示实验中计量资料测定结果，采用统计学分析方法中的方差分析以及t检验，P≤0.05为差异有统计学意义的标准。
　　 结果:
　　 1.肝癌HepG2细胞中livin基因处于高表达状态，其对细胞凋亡有明显的抑制作用。
　　 2.转染携带livin基因的siRNA后，RT-PCR结果显示，livin基因的mRNA表达水平明显下降，相对于对照组与空白组有统计学意义。
　　 3.转染携带livin基因的siRNA后，Western blot检测结果显示，livin基因的蛋白质表达水平明显下降，相对于对照组与空白组有统计学意义。
　　 4.转染携带livin基因的siRNA后，FCM检测发现实验组与阴性对照组和空白组肝癌细胞HepG2在G1期所占比例及细胞早期凋亡率的差异均有统计学意义。
　　 5.转染携带livin基因的siRNA后，TUNEL技术检测表明实验组肝癌细胞HepG2凋亡数目明显增加，细胞凋亡率明显高于其他两组。
　　 结论:
　　 1.Livin基因在肝癌细胞中高表达，参与肝癌的发生发展。
　　 2.Livin-siRNA可以下调肝癌HepG2细胞中Livin基因mRNA和蛋白的表达。
　　 3.在肝癌细胞HepG2中siRNA沉默Livin基因具有诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞生长的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一 肝癌的现状

二 肝癌的治疗进展

材料与方法

主要材料

溶液配置

主要仪器及耗材

实验步骤

结果

一、Livin β-siRNA转染至肝癌细胞HepG2的表达

二、转染Livin β-siRNA至HepG2细胞后对Livin mRNA表达水平的影响

三、转染Livin β-siRNA后抑制细胞中Livin基因蛋白的表达

四、沉默Livin基因对HepG2细胞周期和增殖的影响

五、siRNA沉默Livin基因促进肝癌细胞HepG2细胞凋亡

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文