单链抗体分子构象与其体外生物活性关系的建模分析及应用

摘要

本研究以野生型蛋白的结构为对比标准，利用数学矩阵理论和计算机辅助手段进行同源模建，目的是研究连接肽的序列、长度和柔韧度对构建的单链抗体的结构和功能的影响。
　　第一阶段，用(G4S)n(n=1～9)作为连接肽，通过同源建模和计算机辅助手段，构建单链抗体ND-1ScFv-n(n=1～9)的3D模型。在构建的3D模型中，将构建蛋白与野生型蛋白的结构进行局部比对，找出两者的结构重叠部分，然后在空间坐标系中平移重叠部分，使两者重合后进行主轴和次要轴的确定和空间α碳原子坐标的确定，同时从结构上比较构建蛋白与野生蛋白的结构相似度。结果表示，连接肽的长短对单链抗体的VH和VL区的折叠和结构的影响可以用公式表示:r（n）=√[AB（n）-AB0]2+[CD（n）-CD0]2+[BC（n）-BCst]2，当n=3时，构建的单链抗体ND-1ScFv-3最接近理想模型，当n=6时，构建的单链抗体ND-1ScFv-6与野生型蛋白的结构的相似度最低。
　　第二阶段，将构建的单链抗体进行VL区和VH区的基因扩增、ND-1ScFv-n克隆载体的构建、ND-1ScFv-n表达载体的构建、ND-1ScFv基因的诱导表达、ND-1ScFv-n蛋白的纯化和双切酶鉴定。结果显示:本研究构建的单链抗体成功地表达于E.ColiBL21菌株上，Bradford检测结果显示蛋白浓度大于1.3mg/L，ND-1ScFv-n(n=1～9)获得正确构象，且能够保持有效浓度。用蛋白质印迹分析法(WesternBlot)分析ND-1ScFv-n的免疫活性，结果显示，ND-1ScFv-3保持了与亲本最相近的靶细胞（人大肠癌细胞CCL-187细胞）结合活性，ND-1ScFv-n具有良好的抗体活性和特异性。Western-blot分析结果显示ScFv-n蛋白表达于BL21的溶菌产物的上层清液中的包涵体中。凝胶灰度扫描测定结果显示包涵体蛋白纯度为94％，His-tag在单链抗体的N端。
　　第三阶段，利用成功表达于E.ColiBL21菌株的单链抗体ND-1ScFv-3建立双抗体夹心ELISA检测方法，并初步进行临床样品检测。结果显示，以ND-1ScFv-3为包被抗体的双抗体夹心ELISA检测方法建立成功，对41例大肠癌患者、13例大肠腺瘤患者和32例正常健康者的血清样品检测的阳性率分别为75.61％、76.92％和3.13％，对分化程度越高的大肠癌其检出率也越高。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

前言

参考文献

第一部分 人大肠癌单链抗体分子的优化建模

1 实验材料

1．1 主要仪器

1．2 氨基酸序列

1．3 应用软件及数据库

2 实验方法

2．1 同源模建

2．2 单链抗体蛋白结构的优化建模

2．3 单链抗体VH、VL区首尾距离分析

3 实验结果

3．1 ND-1ScFv-n的蛋白结构分析

3．2 VH区、VL区首尾距离分析结果

4 讨论

参考文献

第二部分 单链抗体ND-1ScFv-n的原核表达及鉴定

1 实验材料

1．1 主要仪器

1．2 引物

1．3 氨基酸序列

1．4 应用软件及数据库

2 实验方法

2．1 RNA的提取及cDNA的合成

2．2 VL和VH基因的扩增及单链抗体的构建

2．3 ND-1ScFv-n克隆载体的构建

2．4 ND-1ScFv-n表达载体的构建

2．5 单链抗体基因的表达及纯化

2．6 单链抗体表达的体外生物活性检测

3 实验结果

3．1 单链抗体的构建结果

3．2 单链抗体的体外生物活性检测结果

4 讨论

参考文献

第三部分 单链抗体ND-1ScFv-n的初步临床应用

1 实验材料

1．1 主要仪器

1．2 引物

1．3 氨基酸序列

1．4 应用软件及数据库

2 实验方法

2．1 应用ND-1ScFv-3建立双抗体夹心ELISA检测技术

2．2 临床样品的检测

3 实验结果

3．1 双抗体夹心ELISA方法的建立结果

3．2 待测临床样品的检测

4 讨论

参考文献

结论

综述 单链抗体研究进展分析

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果