吉西他滨诱导人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6凋亡观察

摘要

背景:
　　 恶性淋巴瘤(Malignant LymPhoma，ML)是原发于淋巴结或结外淋巴组织或器官的一种恶性肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变。根据临床和组织病理特点分为两大类:霍奇金病（Hodgkin disease，HD）和非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymPhoma，NHL)。在我国，HNL所占比例远高于HD，HNL的病理类型、临床表现和治疗远比HD复杂。NHL又分为B细胞来源和T细胞来源，目前对B细胞来源的研究较多，部分病例在相当程度上已成为一类可以治愈的疾病。但来源于T细胞的NHL，虽然在新药应用的研究上提高了一定的疗效，但整体治疗效果比B细胞淋巴瘤差的多，特别是NK/T细胞淋巴瘤。
　　 NK/T细胞淋巴瘤（NK/T cell LymPhoma）属于NHL的一种类型，占全部恶性肿瘤的2％-10％。该病起病隐匿，早期诊断困难，具有高度侵袭性、病程进展快、生存期短和预后差等特点。放化疗为早期病例的主要治疗手段，广泛期和复发难治性病人以化疗为主要治疗方法，以CHOP方案为基础的NHL化疗疗效差。近年来，随着门冬酰胺酶和吉西他滨等药物相继应用于临床，在该病的治疗上收到了较好的疗效，特别是吉西他滨在前期的实验中得到了好的临床治疗效果。
　　 吉西他滨为核苷类细胞周期特异性化疗药物，主要抑制细胞DNA的合成，临床上用于治疗非小细胞肺癌、胰腺癌和妇科肿瘤。在治疗NK/T细胞淋巴瘤的临床实践中发现含吉西他滨的化疗方案疗效优于不含吉西他滨的化疗方案，目前吉西他滨已成为临床治疗NK/T细胞淋巴瘤有效药物研究之一。
　　 细胞凋亡(Programmed Cell Death; PCD)为程序上细胞死亡，即在某些生理信号刺激下，细胞启动内部死亡程序而引起的一种主动死亡方式，在细胞形态上:表现为细胞核的固缩、细胞浆中有新生小体的出现、细胞膜具有完整性等特点;在细胞DNA电泳图谱上:表现为特征性的梯状条带。目前，各种临床治疗肿瘤有效的化疗药物在细胞凋亡方面的研究，已成为细胞生物学和肿瘤学等学科的研究热点。
　　 因此，我们考虑吉西他滨治疗NK/T细胞淋巴瘤，可能是通过诱导细胞凋亡而发挥其主要抗肿瘤作用的，为此设计了吉西他滨诱导人NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6凋亡的实验。
　　 目的:
　　 用吉西他滨诱导人NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6凋亡，通过观察细胞的形态变化和生化改变来了解凋亡的发生情况，并检测凋亡相关基因表达的改变来了解发生凋亡的作用机制。
　　 方法:
　　 1.吉西他滨作用于培养的人NK/T细胞淋巴瘤细胞株SNK-6，用MTT药物敏感实验得出该药的IC50值;
　　 2.用IC50值浓度的吉西他滨作用于SNK-6细胞，用双染式流式细胞技术测定4h、8h、12h、24h、48h时细胞出现凋亡和坏死的情况，并设空白对照组，得到出现最大凋亡率时的药物作用时间;
　　 3.用IC50值浓度的吉西他滨作用于培养的SNK-6细胞，作用时间为用流式细胞技术检测到的出现最大凋亡率时间，同时设空白对照组:
　　 ①电镜观察两组细胞凋亡情况;
　　 ②分别提取两组细胞DNA进行电泳，观察电泳图谱;
　　 ③分别提取两组细胞RNA，逆转录为cDNA,用PCR芯片检测细胞凋亡(aPoPtosis)相关基因的表达。
　　 结果:
　　 1.吉西他滨对SNK-6有明显的抑制作用，随着吉西他滨物浓度及作用时间的增加，其抑制率越来越高，在一定浓度范围内存在剂量依赖性。其IC50值为0.002±3.10μ g/ml。作用48小时抑制率最大。
　　 2.电镜下观察，吉西他滨作用组大部分细胞体积缩小，且在胞膜皱缩细胞的表面出现凋亡小体，极少细胞裂解为碎片;而对照组细胞的细胞核、膜完整，没有凋亡小体形成;
　　 3.吉西他滨作用组DNA电泳呈现出细胞凋亡特征性梯状条带;对照组DNA电泳条带为一大分子片段。
　　 4.吉西他滨作用组与对照组比较，凋亡相关基因MAPK3、MAP3K10、MAP3K14和STAT5b、TGFB1及IL10表达下调，SOX1和CIDEA表达上调。
　　 结论:
　　 吉西他滨在一定浓度和作用时间下，可以诱导NK/T细胞淋巴瘤细胞系SNK-6凋亡，可能是通过上调或下调部分凋亡相关基因而实现的。

目录

声明

摘要

英文缩写词索引

前言

实验材料

1 细胞系

2 药品信息

3 使用仪器

4 使用试剂或实验盒

5 主要试剂配制

实验方法

1．细胞培养

2．细胞计数

3．用MTT法检测吉西他滨对SNK-6细胞的抑制率

4．双染法流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测不同作用时间的细胞凋亡率

5．吉西他滨诱导SNK-6凋亡观察

实验结果

1 吉西他滨对SNK-6的细胞抑制作用

2 MCF仪检测不同作用时间SNK-6凋亡情况

3 两组细胞的电镜观察

4 两组细胞DNA电泳表现

5 两组细胞cDNA凋亡相关基因的表达

讨论

1 吉西他滨对SNK-6细胞的药敏实验

2 吉西他滨诱导SNK-6细胞凋亡的细胞形态和DNA电泳观察

3 双染式流式细胞技术检测吉西他滨作用于SNK-6细胞的凋亡观察

4 吉西他滨诱导SNK-6细胞凋亡的机制

结论

参考文献

综述

致谢