活性氧、p66shc与高浓度葡萄糖下小鼠胚胎发育阻滞的相关性研究

摘要

葡萄糖是细胞生长重要的能源物质，但研究发现早期胚胎暴露在高葡萄糖环境下会抑制其发育，导致胚胎发育阻滞。糖尿病妇女妊娠可引起胚胎发育异常导致妊娠失败，认为造成这一现象的原因也与患者体内高葡萄糖环境影响胚胎发育有关。近期研究发现妊娠合并糖尿病对胎儿的毒性作用在胚胎着床前期即已发生，但葡萄糖抑制早期胚胎发育的机制尚不清楚。目前，研究认为造成这一现象的主要原因是由于高糖环境诱导活性氧簇(Reactiveoxygenspecies，ROS)生成增多，对胚胎造成氧化应激损伤所致。研究证实ROS引起的氧化应激能够对细胞脂质、蛋白质及DNA造成严重损伤影响胚胎的继续发育。
　　 与活性氧生成重要的相关蛋白是SHCA基因编码的p66shc，p66shc作为哺乳类动物重要的生命周期相关蛋白，也是近年来研究细胞氧化应激损伤的主要蛋白之一。p66shc已被证实在糖尿病等相关疾病中起到关键作用，其主要的作用机制为p66shc能够介导产生大量的活性氧簇对机体造成氧化应激损伤。此外，研究显示p66shc能够通过调节细胞内氧化应激水平影响胚胎的发育，在胚胎发育中起到重要作用。但是，高糖环境下引发氧化应激损伤所导致的胚胎发育阻滞是否也与p66shc有关？目前尚不清楚。
　　 目的：
　　 通过在体外培养液中添加不同浓度葡萄糖观察对鼠胚发育的影响，并检测不同发育时期胚胎ROS和p66shc的表达情况，探讨高糖环境下引发的胚胎发育阻滞与ROS和p66shc的关系，尝试阐述糖尿病患者胚胎发育异常的机制，为临床治疗提供实验依据。
　　 方法：
　　 SPF级昆明系雌性小鼠受精卵分别置于葡萄糖浓度为0、5、15、25mM的胚胎培养液中进行体外培养，观察不同葡萄糖浓度对胚胎发育的影响。收集受精卵和各组中2-细胞、4-细胞、囊胚期的胚胎，采用DCFH-DA染料活细胞染色检测ROS的表达，细胞免疫荧光染色检测胚胎中p66shc蛋白的表达情况;实时定量PCR检测p66shcmRNA的表达。
　　 结果：
　　 1.不同葡萄糖浓度对小鼠胚胎发育的影响
　　 胚胎体外培养结果显示:葡萄糖浓度升高到15mM时鼠胚的囊胚形成率明显下降，2-细胞胚胎阻滞率明显升高。15和25mM组的囊胚形成率分别为50.5％和43.4％与0和5mM组囊胚形成率(69％,63.5％)相比明显下降(P＜0.05);在胚胎发育阻滞方面，15和25mM组胚胎发育阻滞率分别为39.6％和37％，显著高于0和5mM组胚胎发育阻滞率(19％，32％)（P＜0.05）。
　　 2.ROS检测结果
　　 ROS检测结果显示:各组中小鼠胚胎2-细胞期ROS的水平显著高于受精卵、4-细胞和囊胚期(P＜0.05);葡萄糖浓度升高，15和25mM组2-细胞和4-细胞期胚胎内ROS的含量显著高于0和5mM组(P＜0.05)，囊胚期随着糖浓度升高胚胎内ROS含量明显上升，四组间差异存在统计学意义（P＜0.05）。
　　 3.p66shc的检测结果
　　 细胞免疫荧光观察可见p66shc蛋白主要定位于胞浆中，并在胚胎发育的各个阶段均有不同程度的表达。应用Real-timePCR在RNA水平检测p66shc的表达情况，结果显示:不同浓度葡萄糖处理对胚胎发育过程中p66shcRNA的表达影响趋势相似，即胚胎2-细胞期p66shcRNA含量明显高于其他发育时期(P＜0.05);随着胚胎的继续发育，p66shc的表达逐渐下降。比较相同发育时期胚胎在不同浓度葡萄糖中p66shc的表达情况发现，2-细胞和4-细胞期胚胎随着糖浓度的升高，p66shcRNA表达量上升，其中15和25mM组显著高于0和5mM组(P＜0.05);而囊胚期不同处理组间p66shcRNA的表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：
　　 1.高浓度葡萄糖影响早期胚胎发育，造成胚胎发育异常，可能与引起胚胎发育阻滞有关。
　　 2.高浓度葡萄糖可能通过诱导ROS生成，对胚胎发育造成氧化应激损伤，从而抑制胚胎发育。
　　 3.p66shc可能作为介导ROS生成的重要蛋白，参与了高浓度葡萄糖对胚胎发育造成的氧化应激损伤。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1．不同浓度葡萄糖环境对小鼠胚胎发育的影响

2．不同葡萄糖浓度下各发育时期鼠胚ROS的表达

3．不同糖浓度组胚胎p66shc的表达检测

讨论

1．不同葡萄糖浓度对小鼠胚胎发育的影响

2．高浓度葡萄糖对胚胎发育的影响

3．高糖环境下胚胎发育阻滞和氧化应激损伤

4．氧化应激中重要的介导蛋白——p66shc

结论

参考文献

综述

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