活性氧、FOXO3a与高浓度葡萄糖环下小鼠早期胚胎发育阻滞的相关性研究

摘要

妊娠合并糖尿病的育龄期妇女容易出现胚胎丢失、早期流产等，造成这一现象的原因可能与其血浆葡萄糖浓度过高导致胚胎发育异常密切相关。研究表明，暴露于高浓度葡萄糖环境下的早期胚胎生长发育受抑制，出现胚胎发育阻滞的现象明显增加。然而，高血糖抑制早期胚胎发育的具体机制尚不清楚。已有的研究表明，高葡萄糖环境中，活性氧簇（Reactiveoxygenspecies，ROS）的产生量显著增加。ROS介导的氧化应激可引起细胞蛋白质、脂质和DNA损伤，严重时可导致胚胎发育障碍。
　　FOXO3a是同ROS相联系的重要转录因子，也是目前研究细胞氧化应激损伤最重要的蛋白之一。研究表明，高浓度的葡萄糖通过诱导ROS过量的产生，导致FOXO3a被磷酸化并失去活性，并使其靶基因—FOXO3a依赖的锰过氧化物歧化酶(manganesesuperoxidedismutase)表达降低，进而产生更多的ROS，并加速氧化应激相关疾病的病理进程。研究显示，FOXO3a对细胞内氧化应激水平的调节作用可改善胚胎的发育，然而，FOXO3a是否参与了高浓度葡萄糖诱导氧化应激损伤而导致胚胎发育阻滞，尚须进一步研究。
　　目的
　　在小鼠胚胎培养基中添加不同浓度的葡萄糖，观察其生长和发育情况，同时在胚胎发育的不同时期对ROS含量和FOXO3a的表达进行检测，研究不同浓度葡萄糖条件下胚胎发育阻滞与ROS、FOXO3a的关系，试图探讨糖尿病妇女胚胎发育异常的机理并为临床治疗提供理论依据。
　　方法
　　对SPF级昆明系雌性小鼠行超促排卵处理，注射HCG后合笼，断颈法处死小鼠后收集合子，基于胚胎培养基中补充葡萄糖溶液后葡萄糖终浓度的高低而将实验分为四组:control组（不添加葡萄糖）、5mM组、15mM组和25mM组，将合子置于以上四个分组的培养液中进行体外培养，观察不同浓度葡萄糖条件下胚胎发育的情况。在胚胎发育的不同阶段（合子期、2-细胞期、4-细胞期及囊胚期），采用DCFH-DA染料活细胞染色法检测ROS的含量，细胞免疫荧光染色检测胚胎中FOXO3a蛋白的表达情况，同时通过RealTimePCR检测FOXO3amRNA的表达。
　　结果
　　1.高浓度葡萄糖影响早期小鼠胚胎发育
　　鼠胚体外培养结果表明:随着培养液中葡萄糖浓度的增高，鼠胚的囊胚形成率不断下降，而2-细胞胚胎发育阻滞率不断升高。15mM组、25mM组的囊胚形成率（分别为50.0％、43.3％）明显低于control组和5mM组(分别为69.9％、63.6％)（P＜0.05）;而15mM组和25mM组胚胎发育阻滞率(分别为37.5％、38.9％)明显高于control组和5mM组(分别为19.4％、21.2％)(P＜0.05)。
　　2.ROS含量的检测
　　ROS检测结果表明:相对于合子、4-细胞和囊胚期胚胎，小鼠2-细胞期胚胎ROS的水平明显升高(P＜0.05);15mM组和25mM组2-细胞、4-细胞期胚胎内ROS水平明显高于control组和5mM组(P＜0.05)，囊胚期胚胎ROS水平随糖浓度升高而上升，但组间差异无统计学意义(P＜0.05)。
　　3.FOXO3a的表达
　　胚胎细胞免疫荧光染色的结果显示，FOXO3a蛋白在胚胎发育的各时期均有不同程度的表达，且主要定位于细胞浆中。行Real-timePCR对FOXO3a在RNA水平的检测结果显示:不同浓度葡萄糖培养鼠胚，在胚胎发育的各时期，FOXO3a的表达与ROS的相对含量密切相关，2-细胞期胚胎FOXO3aRNA表达水平相对于其他发育时期明显升高(P＜0.05);伴随着胚胎继续发育，FOXO3a的表达水平逐渐下降。对于同一发育时期胚胎而言，随着糖浓度的升高，2-细胞、4-细胞期胚胎FOXO3aRNA表达水平降低，其中15mM组和25mM组显著低于control组和5mM组(P＜0.05);而对于囊胚期胚胎，FOXO3aRNA表达的组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论。
　　1.胚胎培养液中高浓度的葡萄糖抑制早期胚胎发育，可导致发育阻滞。
　　2.高浓度葡萄糖可能诱导胚胎ROS过量生成，造成胚胎氧化应激损伤，从而影响胚胎的发育潜能。
　　3.在高浓度葡萄糖对胚胎发育造成的氧化应激损伤中，FOXO3a可能作为ROS的下游靶点，参与了ROS介导的早期胚胎发育阻滞。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

1 材料

2．实验方法

结果

1．不同浓度葡萄糖对小鼠早期胚胎发育的影响

2．不同浓度葡萄糖对小鼠各发育时期胚胎ROS含量的影响

3．不同葡萄糖浓度组中小鼠胚胎FOXO3a的表达检测

讨论

1．不同浓度葡萄糖对小鼠早胚胎发育及囊胚形成的影响

2．高浓度的葡萄糖可导致小鼠早期胚胎发育阻滞

3．高浓度葡萄糖诱导氧化应激参与小鼠胚胎发育阻滞

4．ROS作用的下游靶点——FOXO3a

结论

参考文献

综述 叉头框蛋白FOXO3a与早期胚胎发育阻滞的研究

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