妊娠晚期胎盘组织中Wnt2、sFRP4的表达与重度子痫前期的相关性研究

摘要

妊娠期高血压疾病(Hypertensivediseaseofpregnancy，HDOP)是人类妊娠期特有的疾病，发病率国外报道为6-8％，国内为9.4-10.4％。子痫前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期高血压疾病的一种主要表现形式，目前子痫前期仍是导致新生儿和孕产妇发病率和死亡率的主要原因之一，其中重度子痫前期对母婴的危害更大。子痫前期仅发生于妊娠期，大多数子痫前期患者的临床症状会在胎盘娩出后逐渐消失。妊娠期间胎盘是母体和胎儿的直接接触面，所以胎盘在子痫前期的发病中起中心作用或启动作用。虽然滋养细胞侵袭不足、子宫螺旋动脉重铸不完全导致胎盘浅着床、胎盘缺血是子痫前期发病的主要因素之一，但是子痫前期的发病机理仍未明确，临床仍以对症支持治疗为主。
　　 Wnt信号通路是一条非常保守的信号通路，目前已经发现从水螅到人类都存在这条信号通路，Wnt信号通路在发育过程中起调控细胞命运、增殖、迁徙和极性的作用;同时参与调控成人的自身稳态。该通路不适当的激活会导致多种肿瘤的发生。最近研究表明，Wnt信号通路参与了人类滋养细胞的侵袭分化过程。由于滋养细胞的侵袭分化等功能异常是导致子痫前期发病的重要因素之一，因此，我们推测Wnt信号通路表达异常可能导致滋养细胞功能紊乱，进而导致子痫前期的发生发展。然而，Wnt信号通路与人类子痫前期的相关性研究还比较少见。本研究通过检测Wnt2、sFRP4mRNA和蛋白水平在正常妊娠晚期产妇和重度子痫前期患者胎盘组织中的表达情况，初步探讨其在重度子痫前期发病机制中的作用及意义。
　　 目的：
　　 通过检测Wnt2、sFRP4mRNA和蛋白水平在正常晚孕产妇和重度子痫前期患者胎盘组织中表达情况，探讨其在胎盘组织中的表达变化与重度子痫前期发病的相关性。
　　 方法：
　　 1、研究对象
　　 收集2010年10月到2011年12月在郑州大学第三附属医院住院分娩、经临床诊断为重度子痫前期的产妇胎盘组织20例为病例组。收集同期正常晚孕期产妇的胎盘组织20例为正常对照组。重度子痫前期的诊断严格按照2002年美国妇产科学协会和人民卫生出版社出版的乐杰主编的第七版《妇产科学》的诊断标准。并排除合并慢性高血压、妊娠期糖尿病、肾病、多囊卵巢综合症、胎儿畸形和多胎妊娠的产妇。
　　 2：实验方法
　　 2.1、标本采集与处理
　　 在孕产妇知情同意的情况下，于胎盘娩出后15min内分别于胎盘母体面3、6、9、12点以及中心处收集5块全层胎盘组织，大小为2cm×1cm×1cm，收集标本时避开肉眼可见的坏死、梗塞和钙化处。用无菌滤纸反复吸取胎盘组织中的血液，标本一部分用10％福尔马林固定，一部分装入无菌冻存管内后迅速放入液氮罐内，然后放在-80℃冰箱内冻存备用。
　　 2.2、Real-timePCR检测两组产妇胎盘组织中Wnt2、sFRP4mRNA的表达
　　 Trizol法提取胎盘组织总RNA，反转录为cDNA后，采用染料法进行实时定量PCR，以管家基因三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)为内参基因。采用2-△△CT法分析Wnt2和sFRP4mRNA在两组产妇胎盘组织中的相对表达量。
　　 2.3、免疫组化技术检测Wnt2、sFRP4在两组产妇胎盘组织中的定位表达情况
　　 经石蜡包埋的胎盘组织切至4μm切片，切片包含母体面至胎儿面全层。免疫组化检测Wnt2和sFRP4在两组产妇胎盘组织中的定位表达情况及其染色强度。
　　 2.4、Westernblot技术检测两组产妇胎盘组织中Wnt2、sFRP4蛋白的表达
　　 RIPA法提取胎盘组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。Westernblot检测两组产妇胎盘组织中Wnt2和sFRP4蛋白的表达情况，以目的蛋白与相应的β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。
　　 3、统计学处理
　　 所有数据均采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。数据均以均数±标准差的形式表示。两组数据均符合正态分布的计量资料采用独立样本的t检验，不符合正态分布的计量资料采用Mann-WhitneyU检验。有序多分类资料采用秩和检验。以α=0.05为检验水准。
　　 结果：
　　 1、重度子痫前期组和正常对照组产妇一般临床资料比较
　　 两组产妇年龄、生产前体质指数(bodymassindex，BMI)、空腹血糖和孕产次比较均无统计学差异。重度子痫前期组的妊娠前BMI、血压显著高于正常对照组(P＜0.05);重度子痫前期组尿蛋白定性情况显著高于正常对照组(P＜0.001);重度子痫前期组生产时孕周和新生儿出生体重明显低于正常对照组(P＜0.05)。
　　 2、Wnt2和sFRP4mRNA在重度子痫前期患者和正常产妇胎盘组织中的表达
　　 与正常对照组相比，重度子痫前期组胎盘组织中Wnt2mRNA的相对表达量显著下调，两组比较差异有统计学意义(P=0.003);而子痫前期组患者胎盘组织中sFRP4mRNA的相对表达量与正常对照组相比，差异无统计学意义(P＝0.794)。
　　 3、Wnt2和sFRP4在两组产妇胎盘组织中的免疫组化染色情况
　　 所有的胎盘组织切片在经免疫组化分析前均经苏木素—伊红(hematoxylinandeosin，H&E)染色检测。Wnt2和sFRP4主要在胎盘绒毛合体滋养细胞和母胎界面的绒毛外滋养细胞的细胞膜和细胞质中表达。与正常对照组相比，Wnt2在重度子痫前期组胎盘组织中的免疫染色强度较弱(x2=13.2;P＜0.001)，而sFRP4在重度子痫前期组胎盘组织中的免疫染色强度强于正常对照组(x2=9.9;P=0.002)。
　　 4、Westernblot技术检测两组产妇胎盘组织中Wnt2、sFRP4蛋白的表达
　　 Westernblot分析显示Wnt2蛋白在重度子痫前期组的相对表达量(0.57±0.274)显著低于正常对照组(0.71±0.281)，两组比较，差异有统计学意义(P=0.037);而sFRP4蛋白在重度子痫前期组的相对表达量(0.90±0.202)高于正常对照组(0.70±0.153)，两组比较，差异有统计学意义(P=0.001)。
　　 结论：
　　 人类晚孕期胎盘中存在Wnt2和sFRP4的表达，Wnt2和sFRP4主要在胎盘绒毛合体滋养细胞和绒毛外滋养细胞中表达。Wnt2在胎盘组织中表达降低和sFRP4表达增加可能与子痫前期的发病相关。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

1 引言

1．1 子痫前期概述

1．2 胎盘因素在子痫前期发病中的作用

1．3 Wnt信号通路与子痫前期

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 统计学分析

3 结果

3．1 重度子痫前期组和正常对照组产妇一般临床资料比较

3．2 Wnt2和sFRP4 mRNA在重度子痫前期患者和正常产妇胎盘组织中的表达

3．3 Wnt2和sFRP4在两组产妇胎盘组织中的免疫组化染色情况

3．4 Western blot技术检测两组产妇胎盘组织中Wnt2、sFRP4蛋白的表达

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

个人简历

致谢