口服表达幽门螺杆菌抗原的重级乳酸乳球菌对小鼠免疫保护作用

摘要

目的:
　　 对本课题组前期构建好的H.pylori重组疫苗菌株进行验证、诱导、表达。通过口服灌胃免疫接种BALB/c小鼠，连续免疫一个月后，用H.pylori国际标准株11637进行攻击，检测小鼠胃内H.pylori定植量，评价不同疫苗所产生的免疫应答和免疫保护效果。
　　 方法:
　　 1.将过夜培养好的乳酸菌NZ3900/pNZ8110-ureB、NZ3900/pNZ8110-lpp20、NZ3900/pNZ8110-omp22-hpaA、NZ3900/pNZ8149-ureB、NZ3900/pNZ8110-LysM-hpaA、NZ3900/pNZ8149-SPusp45-ureBnisin诱导表达，离心提取相关蛋白，经SDS-PAGE电泳鉴定重组菌免疫蛋白表达水平，Western-blot鉴定重组蛋白免疫反应性。
　　 2.将过夜培养好的基因工程重组菌TB1（pMAL-c2X-ureB）、TB1(pMAL-c2X-hpaA)、TB1(pMAL-c2X-lpp20)、TB1(pMAL-c2X-omp22)IPTG诱导表达超声破碎提取上清蛋白，经SDS-PAGE验证后，应用直链淀粉亲和层析柱进行纯化，使用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化蛋白的浓度。
　　 3.将BALB/c小鼠随机分为9组，口服免疫后，收集一半小鼠的血清和胃液，酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测特异性抗体含量水平。剩下小鼠用H.pylori进行灌胃攻击，2周后处死小鼠，取小鼠胃组织做尿素酶半定量实验。
　　 4.统计学分析
　　 应用SPSS17.0进行统计分析。各组资料进行正态性检验后，采用单因素方差分析对各组之间保护率进行评价。
　　 结果:
　　 1.SDS-PAGE胶照片显示Nisin诱导重组蛋白Lpp20、UreB、Omp22-HpaA、LysM-HpaA分别在19kd、66kd、53kd、29kd处显示杂交条带，Western-blot显示各重组蛋白均有良好的免疫原性和免疫反应性。
　　 2.各基因工程重组菌诱导表达经直链淀粉亲和层析柱纯化后，SDS-PAGE显示在相应条带均有杂交条带。
　　 3.BALB/c小鼠口服灌胃后，NZ3900/pNZ8110-LysM-hpaA组血清IgG含量最高，其余各重组菌株组均高于阴性对照组(P＜0.05)。H.pylori灌胃攻击后，快速尿素酶检法显示:各重组乳酸菌组OD450值均低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1.获得了纯度较高H.pylori重组抗原UreB、Lpp20、HpaA、Omp22。
　　 2.经口服灌胃均具有免疫反应性。
　　 3.NZ3900/pNZ8110-LysM-hpaA所引起免疫保护效果最佳

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

总技术路线图

第一部分 乳酸菌重组菌株和重组工程菌菌株TB1的诱导、表达及鉴定

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 乳酸菌各重组疫苗的SDS-PAGE表达

2 乳酸菌各重组疫苗的Western-blot鉴定

3 BCA法蛋白标准曲线

4 基因工程重组菌TB1(pMAL-c2X-ureB)、TB1(pMAL-c2X-hpaA)、TB1(pMAL-c2X-lpp20)、TB1(pMAL-c2X-omp22)的诱导、表达

讨论

结论

第二部分 不同乳酸乳球菌重组菌株免疫效果研究

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 抗原包被量与样本最佳稀释度的正交分析结果

2 不同重组乳酸菌所产生的特异性IgG、IgA表达的情况

3 H. pylori攻击小鼠后胃组织定植评价分析

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历

致谢