针对缺血再灌注损伤发展新的治疗策略探索性实验研究

摘要

缺血再灌注损伤是指组织细胞遭受一定时间的缺血缺氧后恢复血流，组织损伤程度迅速增剧的情况。再灌注后大量钙内流，并生成大量氧自由基，是该类组织细胞损伤的主要发病机制。临床上多种疾病如中风、心肌梗死、不可逆性休克、急性脏器功能衰竭及器官移植等的发生、发展都与缺血再灌注有关。
　　第一部分新型双功能试剂四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物用于心脏缺血再灌注损伤的探索性研究
　　目的：
　　建立心脏缺血再灌注模型，探索四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物的自由基清除活性,抗血栓形成活性和较高的稳定性。
　　方法：
　　使用培养基培养P12细胞，置入96孔培养板上，经过24小时粘附阶段后，更换培养基并分别添加浓度为12.5?M,25?M,50?M,100?M,200?M的化合物12a-c至各孔，分别添加浓度为2mM硝普纳(SNP)溶液并置入温箱2小时产生NO损伤，1mM H2O2并置入温箱1小时诱发H2O2损伤，1mM H2O2和30uMFe(II)置于温箱1小时诱发?OH损伤，通过MTT比色测定来计算细胞存活数量，以此评估四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物自由基清除能力，研究结果以EC50(?M)表示，使用方差分析来对这些数据进行统计学处理，p<0.05被认为具有统计学意义。取材大鼠胸主动脉并迅速将其置于灌注液中，加入10-9mol/L去甲肾上腺素(NE)溶液,当高张性收缩达到最大水平时，清洗掉NE固定血管带30分钟。更换溶液，再次添加最终浓度为10-9mol/L的NE。当主动脉带的高张性收缩数值再次达到顶峰时，分别加入15μl生理盐水或15?l浓度为10-6mol/L化合物12c的水溶液。固定后加入15μl最终浓度为10-6mol/L的乙酰胆碱溶液，记录这种测试化合物对乙酰胆碱诱导血管舒张作用的抑制百分率作为结果，评估四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物对乙酰胆碱诱导血管舒张作用的抑制作用。对加入抗凝剂枸橼酸钠的正常兔血离心获得的富含血小板的血浆进行血小板计数，添加自体血浆至2×105/μL浓度，使用PAF或ADP诱发血小板凝集，分别加入四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物并对其结果进行量化分析，选择血小板聚集曲线的顶峰高度为最大血小板聚集率(Am％)。评估四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物抗血小板聚集活性。大鼠麻醉后分离右颈总动脉和左侧颈静脉，将一个称量好的6cm线置于一个聚乙烯管的中央，聚乙烯管充满肝素钠溶液，一端插入左侧颈静脉，从另一端将肝素盐水或测试化合物盐溶液进行注射后，将该端插入右侧颈动脉。15分钟后移开线并称量，记录湿血栓的重量，晾干此线持续2周时间并在此记录干血栓的重量。测定四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物抗血栓活性。将10mg各种测试化合物分别溶于1ml磷酸盐缓冲液(pH8)中，加入0.5毫克胰蛋白酶。使反应混合物保持37℃，使用高效液相色谱法每小时检测一次受试化合物浓度。流动相为含有0.1% CF3COOH的25% CH3OH水溶液。测定四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物12a-c体外对胰蛋白酶的稳定性。建立心肌缺血再灌注模型，麻醉雄性 Wistar大鼠经外科手术操作后于左冠状动脉处留置4-0丝线，假手术组经外科手术操作后不留置丝线，在冠脉阻断前15分钟给予大鼠灌注载体（二甲亚砜-生理盐水，1:103; v/v）或12c（10 mg/kg），冠状动脉阻断30分钟后恢复灌注120分钟，随机分为以下4组：（1）假手术+载体组；（2）假手术+12c组；（3）I/R+载体组；（4）I/R+12c组。检测缺血心肌组织中丙二醛（MDA）含量。实验结束后，再次结扎丝线，通过导管向左心室腔内注射1% Evans蓝溶液来描绘左心室高危缺血区域，取心脏横切片置于1%氯化三苯基四唑（TTC）溶液中，心脏被分为非缺血区域（Evans蓝染色）和缺血再灌注区域（Evans蓝不染色），而后者又分为缺血但存活部分（TTC染色），和梗死区域（TTC不染色）。使用两因素方差分析后，利用原始数据进行 Scheffé’s检验，如果存在差异，使用t检验对成对数据进行分析，如果P<0.05则被认为具有显著差异。
　　结果：
　　所有测试化合物的自由基清除能力(EC50)在如下范围内：对 NO为88-96?M，对H2O2为34-75?M，对?OH为86-95?M。四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物12a,12b和12c的EC50值与1a的结果非常相似，这说明它们具有与1a相似的NO，H2O2和-OH清除能力。对乙酰胆碱诱发血管舒张的抑制百分率来表示，前体化合物1a表现出良好的抑制能力，结果为81.03±4.12%；而四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物(12a-c)则表现出了更高的抑制能力，分别为90.12±1.63,95.77±2.93,和97.15±1.15%。乙酰胆碱诱发的血管舒张作用被四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物1a和12a-c显著抑制。对于ADP-诱发的血小板聚集，使用12a–c浓度为10-6 mol/L血小板聚集率降低至28–30%(NS:55.80%±4.32%;1a:47.83%±3.58%，n=8，p<0.001)。在PAF-诱发的血小板聚集实验中，可观察到类似的结果。四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物很有可能对血小板聚集有非常强的抑制作用。使用12a-c治疗的血栓重量分别为4.85±0.93 mg,3.79±0.29 mg,和2.23±0.16mg(NS:9.28±1.32，p<0.01)。所以，在使用剂量为5μmol/kg的时候，12a-c的抗血栓形成活性要高于11a-c。在胰蛋白酶进行水解作用后12a、12b和12c的耗竭时间分别为4小时、3小时和4小时。再灌注开始120分钟后，MDA含量在假手术组和缺血再灌注及12c治疗组中均较低，但是在缺血再灌注无12c治疗组中，MDA含量为4.90±0.87 nmol/mg组织，而12c可减少MDA含量至2.91±0.63 nmol/mg组织。12c能够减轻脂质过氧化反应和细胞损伤。完全阻断心脏血流30分钟后，发现整个心室均为高危区域，12c治疗组较缺血再灌注损伤组心肌梗死面积的百分率明显降低。
　　结论：
　　四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物具有抗血栓形成能力,自由基清除能力和较高的稳定性，可能能够减轻缺血再灌注造成的损伤。
　　第二部分新颖的氮氧自由基-氨基酸缀合物用于肝脏缺血再灌注损伤的探索性研究
　　目的：
　　本研究试图将抗氧化部分（氮氧自由基）与一系列氨基酸进行链接，以期合成氮氧自由基-氨基酸缀合物，探索其是否能够对肝脏缺血再灌注损伤提供协同保护作用。
　　方法：
　　使用培养基培养P12细胞，置入96孔培养板上，经过24小时粘附阶段后，更换培养基并分别添加浓度为12.5?M,25?M,50?M,100?M,200?M的测试化合物至各孔，分别添加浓度为2mM硝普纳(SNP)溶液并置入温箱2小时产生NO损伤，1mM H2O2并置入温箱1小时诱发H2O2损伤，1mM H2O2和30uMFe(II)置于温箱1小时诱发?OH损伤，通过MTT比色测定来计算细胞存活数量，以此评估氮氧自由基-氨基酸缀合物的自由基清除能力，研究结果以EC50(?M)表示，使用方差分析来对这些数据进行统计学处理，p<0.05被认为具有统计学意义。肝脏缺血再灌注损伤模型，麻醉雄性 Wistar大鼠经外科手术操作后用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，30min后去除血管夹，恢复缺血肝血流。雄性Wistar大鼠被随机分为三组：（1）假手术组(n=4)；（2）缺血再灌注组：肝脏缺血30分钟后恢复灌注2小时（n=8）；（3）缺血再灌注+药物干预组：在恢复灌注前10分钟及恢复灌注后1小时两次给药，均给予测试化合物(n=8)。（1）和(2）组的大鼠使用生理盐水作为对照，进行腹腔内注射。实验结束后处死大鼠，立即取材血液和肝脏标本，于?70℃下冷冻。分别测定血清ALT、AST水平，测定组织匀浆及血浆丙二醛（MDA）水平。将肝脏标本迅速冷冻，切片、并行HE染色。用两因素方差分析后，利用原始数据进行Scheffé’s检验，如果存在差异，使用t检验对成对数据进行分析。如果P<0.05则被认为具有显著差异。
　　结果：
　　氮氧自由基-氨基酸缀合物（NNR和NNK）针对不同自由基表现出与其亲代化合物氮氧自由基（NN）相当的自由基清除能力，其差别无统计学差异。在缺血再灌注组MDA水平(4.86±2.43nmol/mg)较假手术组MDA水平(1.75±0.26nmol/mg)显著升高（P<0.05），L-精氨酸或NNR治疗组均使得MDA水平较缺血再灌注损伤组下降。缺血再灌注组血清ALT水平为1530±750U/L，较假手术组（52±4 U/L）明显升高，且具有显著差异（P<0.001)。NNR+I/R组中ALT水平为173±50 U/L，明显低于I/R组(P<0.05)，但高于假手术组。缺血再灌注组血清AST水平为1894±875U/L，较假手术组（182±30U/L）明显升高，且具有显著差异（P<0.001)。NNR+I/R组中AST水平为510±138U/L，明显低于I/R组(P<0.05)，但依然高于假手术组。虽然NNR治疗组的ALT和AST水平均低于L-精氨酸治疗组，但两者之间均无显著性差异。组织形态学结果说明虽然在 I/R+NNR治疗组中可以看到充血、坏死和肝细胞变化，但是其较I/R组形态学有明显的改善。
　　结论：
　　氮氧自由基-氨基酸缀合物可以显著减少肝脏缺血再灌注造成的损伤。
　　第三部分新型的氮氧自由基-甘氨酸缀合物用于肾脏缺血再灌注损伤的探索性研究
　　目的：
　　利用肾脏缺血再灌注损伤大鼠模型来评估这种新型氮氧自由基-氨基酸缀合物的生物学活性，探讨氮氧自由基-氨基酸缀合物是否能够对肾脏缺血再灌注损伤起到保护作用。
　　方法：
　　使用培养基培养P12细胞，置入96孔培养板上，经过24小时粘附阶段后，更换培养基并分别添加浓度为12.5?M,25?M,50?M,100?M,200?M的测试化合物至各孔，分别添加浓度为2mM硝普纳(SNP)溶液并置入温箱2小时产生NO损伤，1mM H2O2并置入温箱1小时诱发H2O2损伤，1mM H2O2和30uMFe(II)置于温箱1小时诱发?OH损伤，通过MTT比色测定来计算细胞存活数量，以此评估氮氧自由基-甘氨酸缀合物自由基清除能力，研究结果以EC50(?M)表示，使用方差分析来对这些数据进行统计学处理，p<0.05被认为具有统计学意义。取材大鼠胸主动脉并迅速将其置于灌注液中，加入10-9mol/L去甲肾上腺素(NE)溶液，当高张性收缩达到最大水平时，清洗掉NE固定血管带30分钟。更换溶液，再次添加最终浓度为10-9mol/L的NE。当主动脉带的高张性收缩数值再次达到顶峰时，分别加入15?l生理盐水或15?l测试化合物的水溶液。固定后加入15?l最终浓度为10-6mol/L的乙酰胆碱溶液，记录这种测试化合物对乙酰胆碱诱导血管舒张作用的抑制百分率作为结果，评估氮氧自由基-甘氨酸缀合物对乙酰胆碱诱导血管舒张作用的抑制作用。建立肾脏缺血再灌注模型，麻醉雄性Wistar大鼠经外科手术操作，使用动脉夹夹闭肾动脉60分钟，开放恢复血供3小时。大鼠被随机分为3组：（1）对照组：（n=4）；（2）缺血再灌注组：肾脏缺血60分钟后恢复灌注3小时（n=6）；（3）缺血再灌注+药物干预组：在恢复灌注前10分钟及恢复灌注后1小时两次给药，分别通过腹腔内注射的方式给予测试化合物。（1）和（2）组的大鼠使用生理盐水作为对照，进行腹腔内注射。实验结束后处死大鼠，立即取材血液和肾脏标本，于?70℃下冷冻。测定肾脏丙二醛（MDA）水平和谷胱甘肽（GSH）水平、肾脏MPO活性及血尿素氮的水平。将肾脏标本切片、并行HE染色。用两因素方差分析后，原始数据进行Scheffé’s检验，如果存在差异，使用t检验对成对数据进行分析。如果P<0.05则被认为具有显著差异。
　　结果：
　　氮氧自由基-甘氨酸缀合物(GNN)显示出与氮氧自由基(NN)相当的自由基清除能力。较NN而言，并无统计学差异。乙酰胆碱诱发的血管舒张作用被氮氧自由基-甘氨酸缀合物抑制，较 NN而言，无统计学差异。在缺血再灌注组MDA水平较对照组MDA水平显著升高（P<0.05），测试化合物治疗组使得MDA水平较缺血再灌注损伤组下降。缺血再灌注组GSH水平较对照组降低，测试化合物治疗组水平与对照组无明显差异。缺血再灌注组MPO活性较对照组明显升高，测试化合物治疗组使得MPO活性较缺血再灌注损伤组下降。缺血再灌注组血尿素氮水平较对照组明显升高，差异有统计学意义，测试化合物治疗组使得MPO活性较缺血再灌注损伤组明显下降。组织形态学结果说明缺血再灌注导致了肾小球内和肾小管周围的胶原增生，而缺血再灌注损伤+氮氧自由基-甘氨酸缀合物治疗组的肾脏组织的损伤明显减轻。
　　结论：
　　氮氧自由基-甘氨酸缀合物可显著地降低组织脂质过氧化反应的水平，明显地保护肾脏功能和减少组织学改变。
　　第四部分新颖的TEMPO-PEG-RGDs小肽缀合物用于急性下肢缺血性疾病探索性研究
　　目的：
　　通过观察在 ADP-或 PAF-诱发的体外血小板聚集实验和大鼠动脉血栓形成实验中新型化合物 TEMPO-PRG-RGDs缀合物抗小板聚集和抗血栓活性的影响，及TEMPO-PEG-RGDs缀合物进行大鼠主动脉带实验中对缺血再灌注组织中自由基清除能力的研究，探讨TEMPO-PEG-RGDF（作为一种代表化合物）减轻缺血再灌注造成的局部和远程脏器损伤的相关机制。
　　方法：
　　健康清洁级wister大鼠38只（雄性,月龄4月，体重250～300g）被随机分为3组：（1）假手术组：大鼠经受外科手术操作过程（如下所述），但未进行缺血再灌注损伤处理（n=6）；（2）缺血再灌注组：大鼠经受下述外科手术操作，下肢缺血3小时后恢复灌注4小时（n=8）；（3）缺血再灌注损伤+药物干预组：在缺血发生前15分钟及缺血发生后15分钟两次给药，均给予TEMPO-PEG-RGDF缀合物(20 mg/kg)，在再灌注发生前15分钟和再灌注发生1小时后均再次分别腹腔注射 TEMPO-PEG-RGDF缀合物(20 mg/kg)。（n=8）（1）和（2）组的大鼠使用生理盐水进行腹腔内注射作为对照。实验结束时立即分离下肢肌肉及心肌组织，并自升主动脉快速取血，组织标本分为两部分，其中一部分被用于进行脂质过氧化分析，依据Beuge和Aust方法来测定MDA水平评估脂质过氧化反应；另一部分立即在-30℃使用冰冻切片机制作组织切片、HE染色、通过测量组织湿/干重量比值（W/D ratio）来评价组织水肿程度以进行组织形态学研究。使用两因素方差分析后，利用原始数据进行 Scheffé’s检验，如果存在差异，使用t检验对成对数据进行分析。所有的值用均数±标准差表示，如果P<0.05则被认为具有显著差异。
　　结果:
　　在ADP-诱发血小板聚集实验及PAF-诱发血小板聚集实验中，本研究TEMPO-PEG-RGDs缀合物表现出来抗血小板聚集的活性。尤其是在体外细胞实验中TEMPO-PEG-RGDs(最终浓度为100nM;温箱培养时间为120分钟)，与血小板上存在的ADP或 PAF共存时，会显著改变血小板的聚集。本研究利用之前提到的大鼠模型进行体内实验评估了 TEMPO-RGDs and TEMPO-PEG-RGDs的抗血栓作用，血栓重量改变被作为评估指标(表3)。TEMPO-RGDs治疗组(TEMPO-RGDS，TEMPO-RGDV，TEMPO-RGDF)的血栓重量分别为25.9±2.6,25.1±1.9，and22.3±2.2 mg(NS:40.1±2.2 mg)。值得关注的是TEMPO-PEG-RGD(S，V,F)的抗血栓活性，湿血栓重量分别为23.6±2.8,24.7±2.2，and20.7±2.5 mg，较同等剂量(5μmol/kg)阿司匹林治疗组(27.6±2.2 mg)要高。本研究中TEMPO它本身是一种弱的乙酰胆碱诱发血管舒张的抑制剂。相反，乙酰胆碱诱发的血管舒张能够显著地被TEMPO-RGDs或TEMPO-PEG-RGDs缀合物所抑制，且这种抑制作用是剂量依赖性的。同时TEMPO-PEG-RGDs对于乙酰胆碱诱发血管舒张的抑制作用要强于 TEMPO-RGDs，但是两者间并无显著性统计学差异。假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R),缺血再灌注损伤+药物干预组组织水肿评估显示：Sham(3.18±0.25)，(I/R)组（5.60±0.37）(I/R+TEMPO-PEF-RGDF)（3.45±0.21），可见缺血再灌注组组织水肿情况较对照组明显加重(P<0.05)，但通过使用TEMPO-PEF-RGDF小肽缀合物后，较缺血再灌注组组织水肿情况明显好转(P<0.05)。本研究也通过进行丙二醛（MDA）过氧化物歧化酶（SOD）定量分析来评价氧化应激反应，假手术组(Sham),缺血再灌注组(I/R),缺血再灌注损伤+药物干预组(I/R+TEMPO-PEG-RGDF) SOD和MDA水平检测是：假手术组SOD（5.38?1.45）与MDA（2.19?0.38）；缺血再灌注组(I/R) SOD（3.74?1.52）与MDA（5.65?0.29）；药物干预组(I/R+TEMPO-PEG-RGDF) SOD（5.09?0.83）和MDA（2.37?0.44）。可见SOD和MDA的活性表达在假手术组与缺血再灌注组之间存在明显统计学意义(P<0.05)，而在缺血再灌注组与药物干预组同样存在明显差异(P<0.05)。因此，本研究认为TEMPOL本身治疗能够逆转MDA的升高水平至一个较低的程度。SOD抑制自由基和粘附分子的表达，所以能够对肌肉缺血再灌注损伤产生保护作用。冰冻切片机制作组织切片、HE染色进行组织形态学研究示：假手术组大鼠骨骼肌横切面切片显示了正常的结构（HE染色），可见典型的肌束外包的肌束膜，同等大小的肌纤维以镶嵌模式排列。相反，缺血再灌注组切片可见肌肉水肿、中性粒细胞聚集和细胞死亡。改良三色染色可以显示间质水肿，肌原纤维溶解，细胞膜破裂，细胞水肿和坏死，及可见散发的破裂红纤维，都说明出现广泛的细胞损伤。另外，I/R组大鼠骨骼肌组织切片的NADH(烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸)染色可发现氧化代谢酶的无序分布。特别是在 NADH染色中慢肌纤维染色较深，相反快肌纤维染色较浅因为糖酵解能力强且线粒体含量较低，TEMPO-PEG-RGDF干预还是缓解了大部分损伤。除了H/E染色中偶见的空泡化纤维外，大多数肌肉纤维拥有完整的清楚边界，内容物质地均匀，形态均匀一致。同时绝大多数纤维中NADH反应较弱，反应了TEMPO-PEG-RGDF对于缺血再灌注损伤的治疗作用确实保护了大多数的组织。
　　结论：
　　本项研究使用新型化合物 TEMPO-PRG-RGDs缀合物进行 ADP-或PAF-诱发的体外血小板聚集实验和大鼠动脉血栓形成实验，实验结果显示TEMPO-PEG-RGDs缀合物具有显著的抗血小板聚集和抗血栓活性。同时，使用TEMPO-PEG-RGDs缀合物进行大鼠主动脉带实验来评估其自由基清除能力。TEMPO-PEG-RGDF（作为一种代表化合物）同样显示了其具有减轻脂质过氧化反应，减轻缺血再灌注造成的局部和远程脏器损伤的潜力。本项研究推测 TEMPO-PEG-RGDs可能刺激单核细胞，且其氮氧自由基能够清除细胞内超氧离子和羟基自由基，从而抑制组织因子的合成而起到抗血栓形成的作用。PEG化学修饰可延长TEMPO-PEG-RGDs缀合物的半衰期及在血液循环中的持续时间，从而提高治疗作用。我们预言，新颖的TEMPO-PEG-RGDs缀合物有可能发展成为治疗缺血再灌注损伤的有效药物。
　　第五部分新奇的小肽缀合物用于急性下肢缺血探索性研究
　　目的:
　　通过将β-咔啉生物碱多肽与溶栓多肽进行链接，以探求β-咔啉生物碱-小肽缀合物的抗氧化和溶栓双重活性；同时建立下肢缺血再灌注损伤模型，探索小肽缀合物对缺血肢体的保护性作用及机制，从而为临床治疗骨骼肌缺血再灌注肾损伤提供理论依据。
　　方法：
　　健康清洁级雄性Wistar大鼠(250-300 g;食水不限)被随机分为3组：（1）假手术组（n=6）：大鼠经受外科手术操作过程，但未进行缺血再灌注损伤处理；（2）缺血再灌注组（n=8）：大鼠经受下述外科手术操作，下肢缺血3小时后恢复灌注4小时；（3）缺血再灌注损伤+药物干预组（n=8）：在恢复灌注前15分钟及恢复灌注后1小时两次给药，均给予β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)（20mg/Kg）。（1）和（2）组的大鼠使用生理盐水作为对照，进行腹腔内注射。实验结束后处理大鼠，立即分离下肢肌肉及心肌组织，并自升主动脉快速取血，组织标本分为两部分，其中一部分使用硫代巴比妥酸反应产物生物化学分析法检测细胞膜脂质过氧化指标血浆丙二醛（Malondialdehyde，MDA）活性，以定量评价缺血危险区脂质过氧化程度，另一部分立即在-30℃使用冰冻切片机制作组织切片进行组织形态学研究。利用细胞活体使用PC12细胞测试β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a,b,c)及其前体2a,b,c在对抗NO,H2O2和?OH时的自由基清除能力，研究结果以EC50(?M)表示。通过大鼠活体研究评估β-咔啉生物碱-小肽缀合物(24a,b,c,25a,b,c,26a,b,c)是否具有母体化合物类似的溶栓活性。最终使用两因素方差分析后，利用原始数据进行 Scheffé’s检验，如果存在差异，使用t检验对成对数据进行分析。所有的值用均数±标准差表示，如果P<0.05则被认为具有显著差异。
　　结果:
　　β-咔啉生物碱-小肽缀合物溶栓活性评估结果显示：所有检测物的清除能力（EC50）分别为：对NO为77-110?M，对H2O2为38-66?M，对?OH为72-94?M。β-咔啉生物碱-小肽缀合物在体外胰蛋白酶作用下的稳定性研究结果显示：β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a，26b和26c)在体外胰蛋白酶作用下衰竭时间分别为4小时，3小时和3小时。β-咔啉生物碱-小肽缀合物对于脂质过氧化反应标记物-丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平影响显示：肌肉缺血再灌注损伤组 I/R的缺血骨骼肌 MDA含量（7.8?0.3）较对照组Sham（0.6?0.1）明显升高(P<0.05)，同时使用β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)进行干预后即I/R+26a组MDA（2.8?0.2）水平明显回落(P<0.05)。肌肉缺血再灌注损伤组I/R的缺血骨骼肌GSH含量（0.2?0.05）较对照组 Sham（1.3?0.2）明显降低(P<0.05)，同时使用β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)进行干预后即I/R+26a组GSH（1.0?0.1）水平明显升高(P<0.05)。心肌缺血再灌注损伤组 I/R的缺血骨骼肌 MDA含量（5.1?0.4）较对照组Sham（1.3?0.1）明显升高(P<0.05)，同时使用β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)进行干预后即 I/R+26a组 MDA（1.5?0.1）水平明显回落(P<0.05)。心肌缺血再灌注损伤组 I/R的缺血骨骼肌GSH含量（4.9?1.7）较对照组Sham（16.8?2.1）明显降低(P<0.05)，同时使用β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)进行干预后即I/R+26a组GSH（14.7±3.2）水平明显升高(P<0.05)。血液中缺血再灌注损伤组 I/R的缺血骨骼肌MDA含量（5.8±0.3）较对照组Sham（2.5?0.1）明显升高(P<0.05)，同时使用β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)进行干预后即 I/R+26a组MDA（2.8±0.2）水平明显回落(P<0.05)。心肌缺血再灌注损伤组I/R的缺血骨骼肌GSH含量（4.1±0.3）较对照组Sham（4.1±0.3）明显降低(P<0.05)，同时使用β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)进行干预后即I/R+26a组GSH（9.1±0.2）水平明显升高(P<0.05)。组织形态学研究：对骨骼肌冰冻横截面切片行HE染色进行常规组织学分析，假手术组大鼠切片结果显示肌纤维具有均匀的大小和形状，成镶嵌分布，多数彼此之间直接接触，期间仅有一层薄薄的肌内膜，总体来说，是正常的组织学表现。相反，缺血3小时后再灌注导致重度的间质水肿，及以肿胀和炎症细胞浸润为特征的损伤。另一方面，使用β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)进行干预后可预防间质水肿，微血管的横截面区域基本上没有改变。使用H/E染色的假手术组大鼠心肌切片显示正常的结构和紧密的心肌排列。缺血再灌注损伤组中再灌注引起的心肌损伤是明显的，体现在血管周围区域和肌纤维之间的组织水肿。水肿广泛存在于心肌纤维和血管周围。缺血再灌注+β-咔啉生物碱-小肽缀合物治疗组中坏死并不明显，且在间质区和小血管内仅可观察到非常少量的炎症细胞。
　　结论:
　　本项研究使用药物干预缺血再灌注损伤以期获得治疗效果，一系列新合成的β-咔啉生物碱-小肽缀合物，在动物模型和细胞实验中，均表现出溶栓活性和自由基清除能力。本项研究选择其中一种β-咔啉生物碱-小肽缀合物(26a)在下肢缺血再灌注损伤模型中进一步实验，发现其具有有效的自由基清除能力和溶栓活性,能够对抗大鼠肢体缺血再灌注引发的局部和远隔器官的损伤，而起到保护作用。本项研究结果显示β-咔啉生物碱-小肽缀合物可能成为一种新的抗缺血再灌注损伤的治疗方法。
　　第六部分氮氧自由基缀合物联合缺血后处理对下肢缺血再灌注损伤治疗作用的实验研究
　　目的：
　　本项研究通过对缺血组织后处理并联合静脉注射氮氧自由基缀合物的方式来共同应对缺血再灌注损伤，评估甘氨酸-氮氧自由基缀合物联合缺血后处理在急性下肢缺血再灌注损伤大鼠模型中的相关治疗作用。
　　方法：
　　健康清洁级wister大鼠38只（雄性,月龄4月，体重250～3000g）随机分五组：假手术组（n=6）：仅进行常规麻醉，不阻断后肢血流7h处理动物；缺血再灌注组（n=8）：止血带完全阻断后肢血流3h，松解阻断4h后处理动物；缺血再灌注+GNN治疗组（n=8）:止血带完全阻断后肢血流3h，按30mg/kg剂量经口喂食GNN药丸，于恢复灌注前15分钟以10mg/kg/min静脉注射GNN，松解阻断4h后处理动物；缺血后处理合并静脉注射生理盐水组（n=8）:止血带完全阻断后肢血流3h，松解阻断后，以60秒间隔反复阻断后恢复灌注四个循环，以上述剂量于恢复灌注前15分钟静脉注射生理盐水，4h后处理动物；缺血后处理合并静脉注射GNN组（n=8）:止血带完全阻断后肢血流3h，松解阻断后，以60秒间隔反复阻断后恢复灌注四个循环，以上述剂量于恢复灌注前15分钟静脉注射GNN，4h后处理动物。按各组要求时间点立即于升主主动抽取血液标本5ml，离心后取血清，装入无菌冻存管，－70℃冻存备用。并迅速取材各组织脏器，分为两份，其中一份部分组织称重以生理盐水制备成10%匀浆，离心后取上清液装入干净冻存管，液氮冻存，进行湿重/干重（W/D）比例的测定、组织匀浆及血浆丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测定、组织匀浆髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性测定、血清丙氨酸转氨酶（ALT），天冬氨酸转氨酶（AST），血尿素氮（BUN）及血肌酐（Cr）含量测定及血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平测定；另一部分组织用于干/湿比的测定。另一份冰冻切片机于-30℃温度下行组织切片，采用HE染色，观察组织形态的改变。最终数据使用双因子方差分析后加用Scheffé’s检验来对组间差异进行比较，如果存在差异，使用t检验来比较成对数据。结果表达为均数±标准差。如果P<0.05则被认为具有显著差异。
　　结果：
　　血浆及肺组织匀浆MDA水平：缺血再灌注损伤组血浆（3.45±0.44nmol/ml）及肺组织（84.5±3.7nmol/g tissue）中MDA水平均较假手术组（血浆:1.67±0.13nmol/ml）；肺组织：41.8±3.2nmol/g tissue））明显升高。但是单纯缺血后处理组大鼠MDA水平较缺血再灌注损伤组大鼠无明显下降。单纯GNN治疗（血浆:2.28±0.38nmol/ml）；肺组织：60.3±3.5nmol/g tissue））与GNN联合缺血后处理治疗（血浆:1.89±0.20nmol/ml）；肺组织：52.7±4.9nmol/g tissue））均可明显抑制MDA产生，这说明其可减弱脂质过氧化反应及细胞损伤。组织氧化应激损伤的指标——髓过氧化物酶（MPO）活性结果：缺血再灌注组大鼠 MPO水平（19.3±1.9 U/g）较假手术组大鼠（8.0±0.6 U/g）显著升高。单纯GNN治疗组大鼠（10.4±1.2 U/g）及GNN合并缺血后处理治疗组大鼠（9.3±1.3 U/g）较缺血再灌注损伤大鼠的肺 MPO活性明显降低。血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）结果：缺血再灌注损伤组大鼠（130.6±5.7 pg/ml）较假手术组大鼠（51.2±6.9 pg/ml）的TNF-α水平显著升高。单纯GNN治疗组（85.8±9.1 pg/ml）及GNN合并缺血后处理治疗组（72.2±9.5 pg/ml）均较缺血再灌注损伤组的炎性细胞因子水平均显著下降，GNN合并缺血后处理叫单纯GNN治疗更加有效，但是这些组间并无统计学差异。组织水肿的程度可通过测量组织湿干比（W/D）来进行评价，结果所示再灌注损伤后组织水肿明显。缺血再灌注损伤组大鼠较假手术组大鼠血清AST及ALT水平均明显升高，说明导致了严重的肝细胞损伤。单纯GNN治疗组大鼠及GNN合并缺血后处理进行干预均可有效降低ALT及AST的水平。缺血再灌注组较假手术组血BUN水平明显升高，单独给予GNN干预及GNN合并缺血后处理治疗均可显著降低血BUN水平。而且急性下肢缺血再灌注损伤确实导致血Cr浓度升高，而单独给予GNN干预及GNN合并缺血后处理治疗同样可显著降低Cr水平。
　　结论：
　　在该项研究中我们发现，单纯进行缺血后处理（间隔为60秒的四组循环）干预并未能起到显著的保护作用。但是当缺血后处理与氮氧自由基缀合物GNN共同作用时，两者共同作用的治疗效果就相当显著了。这向我们提示缺血后处理联合GNN共同干预可能能为抗缺血再灌注损伤提供一个新的治疗方案。

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引言

第一部分 心脏缺血再灌注损伤

第一节：针对缺血再灌注损伤的心脏保护作用：基础和转化研究

第二节：新型双功能试剂四氢-β-咔啉-RGD类肽缀合物用于心脏缺血再灌注损伤探索性研究

第二部分 肝脏缺血再灌注损伤

第一节：基于实验模型的肝脏缺血再灌注损伤的研究现状

第二节 新穎的氮氧自由基-氨基酸缀合物用于肝脏缺血再灌注损伤探索性研究

第三部分 肾脏缺血再灌注损伤

第一节：肾脏缺血再灌注损伤：炎症和微血管病变

第二节：新型的氮氧自由基-甘氨酸缀合物用于肾脏缺血再灌注损伤探索性研究

第四部分 下肢缺血性疾病

第一节：基于实验模型的下肢缺血性疾病的研究现状

第二节：新奇的小肽缀合物用于急性下肢缺血探索性研究

第三节：新穎的TEMPO-PEG-RGDs小肽缀合物用于急性下肢缺血性疾病探索性研究

第四节：氮氧自由基缀合物联合缺血后处理对下肢缺血再灌注损伤治疗作用的实验研究

结论

综述: 缺血再灌注损伤的治疗进展

致谢

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