MACC1基因沉默通过ERK通路对卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感性的影响

摘要

背景
　　作为一种严重威胁女性健康和生命的恶性肿瘤，卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤第一位。卵巢癌具有起病隐匿、发现晚、转移早、进展快及预后差的特点。目前卵巢癌的发病机理仍不十分清楚。由于卵巢居于盆腔底部，所以卵巢癌缺乏早期特异性症状，患者因腹胀等原因就诊时约70％已是晚期。晚期卵巢上皮性癌行肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的化学治疗。肿瘤细胞减灭术旨在最大限度和范围的切除肿瘤组织，但术后可能残留的病灶仍然无法避免。因此，化疗对晚期卵巢癌患者来说必不可少。但部分患者对化疗药物尤其一线药物顺铂耐药却造成治疗失败。化疗耐药又可分为内在性耐药和获得性耐药两大类:约15％-25％的卵巢癌患者对以铂类为基础的联合化疗方案内在性耐药，即为原发耐药;而至少80％的接受化疗的患者在治疗过程中逐渐对顺铂产生耐药性，称为获得性耐药，即为继发性耐药。化疗耐药严重制约着卵巢癌患者的生活质量和生存期。因此，近年来，科学研究者在不断寻找改善患者化疗敏感性的方法。
　　2009年，Stein等在结肠癌中发现了一个新的基因，因其与结肠癌的转移密切相关，因而这个基因被称为结肠癌转移相关基因-1(Metastasis-associatedincoloncancer-1，MACC1)。MACC1是肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)/C-MET信号转导途径的重要调节因子，通过在转录水平上增强c-met的表达，在结肠癌的侵袭、转移过程中起着重要作用。后来，国内外科学研究者在多种人类恶性肿瘤中发现了MACC1的高表达，比如肝细胞癌、胆囊癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等。本课题组前期研究发现，卵巢上皮性癌中MACC1mRNA及蛋白表达显著高于其在卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达;并合成了MACC1基因特异性shRNA，成功转染人卵巢癌细胞OVCAR-3，通过一系列功能实验发现转染后OVCAR-3细胞的增殖、迁移、侵袭能力减弱，而凋亡增加;通过RT-PCR和WesternBlot发现转染细胞的C-met、p-ERK1/2、cyclinD1、survivin、MMP9、MMP2及VEGFA等表达显著减少，提示MACC1可能通过HGF/C-met信号通路及下游的MAPK通路来调节肿瘤相关的一系列基因表达来参与卵巢癌的恶性进展过程。但MACC1是否参与卵巢癌对顺铂敏感性的调节，目前国内外尚无文献显示。
　　本研究通过RNA干扰(RNAinterferring，RNAi)技术分别抑制人上皮性卵巢癌细胞亲本株SKOV3和相应的顺铂耐药株SKOV3/DDP细胞中MACC1表达，应用RT-PCR检测细胞中MACC1基因的mRNA的表达情况，同时采用westernblot方法检测MACC1、ERK1/2、p-ERK1/2、caspase-3及cleavedcaspase-3蛋白的表达，MTT法检测细胞增殖及顺铂敏感性变化，Transwell法研究细胞体外侵袭能力的变化，探讨MACC1基因抑制对上皮性卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响，以及MACC1基因抑制后ERK通路蛋白的变化，试图进一步了解MACC1是否通过ERK通路对卵巢癌顺铂敏感性产生影响，并为寻求临床上有效逆转卵巢癌耐药提供新的思路。
　　目的
　　通过RNA干扰技术分别抑制SKOV3和SKOV3/DDP细胞中MACC1表达，分析MACC1基因抑制后卵巢癌细胞增殖、凋亡及顺铂敏感性的变化，分析MACC1影响卵巢癌上述生物学行为的分子机制，为临床上逆转卵巢癌耐药提供一个新的思路。
　　方法
　　1.前期设计的针对MACC1mRNA的小发卡状RNA转染卵巢癌细胞SKOV3，RT-PCR及Westernblot分别检测MACC1mRNA和蛋白表达，并检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白含量的变化以及ERK通路抑制剂PD98059对上述蛋白水平的影响。MTT法评价细胞对顺铂化疗敏感性的变化。
　　2.前期设计的针对MACC1mRNA的小发卡状RNA转染卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP，RT-PCR及Westernblot检测MACC1mRNA和蛋白表达，并检测ERK1/2及p-ERK1/2、caspase-3及cleavedcaspase-3蛋白含量的变化以及ERK通路抑制剂PD98059对上述蛋白水平的影响。MTT法、FCM法和Transwell实验分别评价细胞增殖能力和顺铂化疗敏感性、凋亡的变化及细胞体外迁移能力的变化。
　　3.统计学处理:利用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析。所得数据均以均数士标准差（(x)±S）表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数两两比较采用LSD法方差分析。检验水准α=0.05，以p＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果
　　1.在SKOV3中，转染MACC1shRNA的细胞可检测到MACC1mRNA和蛋白的低表达;p-ERK1/2表达明显降低，细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50)明显低于空白对照组和转染空质粒组。在此基础上加入PD98059后p-ERK1/2表达及IC50改变更为明显。
　　2.MACC1沉默的SKOV3/DDP细胞中，MACC1mRNA和蛋白表达降低，p-ERK1/2及caspase-3表达降低，cleavedcaspase-3升高。同时，MACC1沉默的SKOV3/DDP细胞增殖和迁移能力减弱、凋亡增加、对顺铂敏感性提高。PD98059能够进一步促进以上变化。
　　结论
　　1、MACC1可能参与卵巢癌对顺铂的敏感性调节
　　2、MACC1可能通过下游的ERK通路调节卵巢癌的增殖、凋亡、侵袭及顺铂敏感性

目录

声明

摘要

引言

第一部分 MACC1基因表达下调对卵巢上皮性癌细胞SKOV3顺铂敏感性的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二部分 MACC1基因干扰对卵巢上皮性癌耐药细胞生物学行为和顺铂敏感性的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

附图

综述一 RNAi抑制卵巢癌分子通路及靶向治疗

综述二 MACC1研究进展

个人简历及在校期间发表论文情况

致谢