肾损伤分子1对高糖诱导人肾小管上皮细胞自噬作用的影响

摘要

背景及目的:糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的并发症之一，其主要以进行性肾间质纤维化(RIF)形成为特征，是导致终术期肾脏疾病(ESRD)的主要原因。因此，探讨糖尿病肾病的进展机制，寻求防治糖尿病肾病的新靶点具有重要意义。自噬是细胞维持蛋白代谢平衡及内环境稳定的一种方式，可被包括活性氧(ROS)、内质网应激、缺氧等多种形式的细胞应激反应所激活，而上述应激反应在糖尿病肾病的发生发展机制当中同样起重要作用。同时，近期的研究提示，细胞自噬水平的增加与RIF的进展明显相关。肾损伤分子1(KIM-1)是由受损近端肾小管上皮细胞表达的一种跨膜糖蛋白。许多研究表明KIM-1是一种在判断肾脏损伤和疾病预后中敏感而又特异的指标。然而近期的研究发现KIM-1不仅可作为一种肾脏损伤的非侵袭性指标，更在肾脏的损伤和修复中起到了重要作用。在急性肾脏损伤(AKI)当中，KIM-1可促使肾小管上皮细胞向“半专业”吞噬细胞转化，增强细胞的自噬功能;在包括糖尿病肾病在内的多种慢性肾脏病(CKD)当中，KIM-1与RIF的程度呈正相关。而在糖尿病肾病当中，KIM-1是否可对细胞自噬作用进行调控，从而参与糖尿病肾病的进展并不清楚。本实验以人近端肾小管上皮细胞为研究对象，以体外高糖培养环境为刺激因素，观察KIM-1对不同高糖处理时间条件下肾小管上皮细胞自噬相关蛋白～微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(LC3Ⅱ)（自噬存在的标志分子，其含量的多少与自噬泡数量呈正比）和细胞自噬体（经透射电子显微镜观察，为诊断细胞自噬的金标准）的影响，明确KIM-1与细胞自噬的关系，探讨KIM-1参与糖尿病肾病进展的可能机制，从而为DN的防治提供新的思路和靶点。
　　方法:体外培养HK2并进行如下分组:(1)正常对照组(D-葡萄糖5.6 mmol/L);(2)高渗组(D-葡萄糖5.6 mmol/L+D-甘露醇24.4 mmol/L);(3)高糖组(D-葡萄糖30mmol/L);(4)高糖+KIM-1 siRNA组;(5)高糖+siRNA对照组。分别于不同培养时间条件下进行测定。Western印迹法检测细胞KIM-1、自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(LC3Ⅱ)蛋白的表达;实时定量PCR法(real-time PCR)检测细胞KIM-1、LC3Ⅱ mRNA的表达。透射电子显微镜下观察细胞内自噬体的形成。
　　结果:正常对照组及高渗组中KIM-1蛋白和mRNA几乎无表达;与正常对照组相比，高糖组细胞培养8h后KIM-1蛋白和mRNA即有明显表达，并随着高糖诱导时间延长，表达量呈时间依赖性增加，差异有统计学意义;
　　正常对照组及高渗组LC3Ⅱ蛋白和mRNA均有少量表达，两组表达量无明显差异，与正常对照组相比，高糖组培养8h、16h、24h后LC3Ⅱ蛋白和mRNA表达呈时间依赖性增加，差异有统计学意义;正常对照组与高渗组细胞内均有少量自噬体形成，两组自噬体数量无明显差异，与正常对照组相比，高糖组细胞内自噬体数量明显增多，并呈时间依赖性;
　　与高糖组相比，KIM-1 siRNA转染组细胞KIM-1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA表达量均明显下降，细胞自噬体形成数量明显减少。
　　结论:
　　1、高糖环境下肾小管上皮细胞KIM-1和LC3Ⅱ表达增多，细胞自噬体形成增多;
　　2、高糖环境下抑制KIM-1的表达能同时明显抑制肾小管上皮细胞LC3Ⅱ的表达和自噬体的形成，提示KIM-1可能通过调控肾小管上皮细胞自噬作用参与糖尿病肾病的进展。

目录

声明

摘要

主要符号和缩略语说明

1、前言

2、材料及方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3、结果

3．1 高糖对HK2表达KIM-1的影响

3．2 高糖对HK2表达LC3Ⅱ的影响

3．3 高糖对HK2自噬体形成的影响

3．4 高糖环境KIM-1 siRNA的干扰效率

3．5 KIM-1 siRNA转染对高糖环境下肾小管上皮细胞表达KIM-1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA含量及细胞内自噬体形成数量影响

4、讨论

5、结论

参考文献

综述 细胞自噬在肾脏疾病中的研究现状

个人简历

致谢