非肌肉肌球蛋白NMⅡA通过JNK信号途径调控胃癌细胞的迁移与侵染

摘要

胃癌（gastric cancer）是中国最常见的消化道恶性肿瘤之一。胃癌的发病率在亚洲国家包括中国在内仍然居高不下；然而胃癌的发病率在世界范围内呈下降趋势。我国是胃癌发病大国，因此针对胃癌的研究显得尤为重要。由于胃癌早期多无症状或缺乏典型的临床表现，诊断率不足，多数患者就诊时已进入胃癌进展期，胃癌一旦进入晚期或转移性阶段,传统的治疗效果不理想，预后较差。对晚期胃癌患者使用手术治疗，和术后的化疗，对提高患者的生存率没有明显的作用。晚期胃癌患者手术后5年的生存率并没有明显的提高，死亡率仍保持在较高水平。目前常用的放化疗和手术治疗等癌症治疗方法，可能会导致机体免疫力的降低。临床上通过 TNM分期、淋巴结转移和肿瘤组织学类型，对患者进行术前评估和预后判断，效果也不是很理想。因此寻找新的胃癌治疗方法迫在眉睫。近些年来,随着分子生物学与免疫学的迅速发展,研究方法的不断进步寻找新的胃癌转移和侵袭过程中的相关基因，阐明其可能的作用机制。因此，寻找新的分子对胃癌的研究具有重要意义。
　　非肌肉肌球蛋白NMⅡA特异的存在于血小板、中性粒细胞和淋巴细胞中。近年来越来越多的研究发现 NMⅡA在细胞的迁移、黏附、肿瘤的发生发展以及机体的免疫应答等生理过程中起着重要的作用。
　　在本研究中，我们首先观察了NMⅡA在胃癌病理组织中和5种胃癌细胞系的表达情况，分析了NMⅡA的表达水平与胃黏膜癌变不同阶段的表达，以及临床病理学特征的关系；本研究同时观察了NMⅡA对胃癌细胞系的转移和侵袭的影响；研究了NMⅡA抑制胃癌细胞迁移和侵袭相关的信号通路。进一步的明确NMⅡA在胃癌胃癌迁移和侵袭的作用途径，是今后研究胃癌的一个新的作用靶点。本研究分为以下三个部分:
　　第一部分、NMⅡA在胃癌组织中的表达和临床意义
　　方法：
　　1.收集2008到2014年之间在郑州大学第一附属医院接受胃癌手术切除治疗的胃癌组织标本和及相应配对癌旁组织标本，共计选取病例163例，检测NMⅡA在胃癌患者中组织标本和及相应配对癌旁组织标本的表达。
　　2.利用Real-time PCR和Western blot从基因水平和蛋白水平验证4例胃癌组织标本和及相应配对癌旁组织标本的NMⅡA的表达情况。
　　3.收集和利用统计学分析胃癌患者临床病理资料，研究其与NMⅡA表达水平的相关性；
　　4.统计分析NMⅡA表达在胃黏膜癌变不同阶段的表达
　　结果：
　　1.免疫组化染色结果显示，NMⅡA在胃癌组织中的表达水平显著高于相应的癌旁组织（P<0.001）。利用显微镜观察，在胃癌组织中，NMⅡA的表达水平很高，且主要分布于细胞浆及细胞膜中；而在其相应的癌旁组织标本中， NMⅡA的表达量不高，且主要分布于细胞核中。NMⅡA在163例胃癌组织中有145例表达呈阳性，表达阳性率为89.0％，而在163例癌旁组织中仅有51例表达呈阳性，表达阳性率为30.1%。以上结果说明和癌旁组织相比，NMⅡA的表达水平明显升高，具有显著性差异（P<0.001）。在4例新鲜胃癌组织及对应的癌旁组织中，利用Realtime PCR和Western blot进一步检测NMⅡA的表达情况，结果与免疫组化结果一致，4例胃癌组织中NMⅡA的表达明显高于相应癌旁组织。
　　2.NMⅡA的表达水平与胃癌的浸润深度、胃癌TNM分期和淋巴结转移有一定的关系。统计结果显示，NMⅡA的表达水平与胃癌的浸润深度，尤其是在全层（P<0.001）、TNM分期，尤其是III期和IV期（P<0.001）、淋巴结转移，尤其是N1+阶段（P<0.001）密切相关。NMⅡA在高深度浸润、高TNM分期和有淋巴结转移的胃癌病例中的表达水平越高。
　　3.NMⅡA的表达与胃癌分化程度及幽门螺杆菌感染亦无明显相关，在肠型胃癌和弥漫型胃癌中表达无显著差异。
　　第二部分、NMⅡA对胃癌细胞恶性生物学行为的影响
　　方法：
　　1.选取5种胃癌细胞系和1种非癌细胞GES-1细胞（永生化胃黏膜上皮细胞）作为对照，利用Western blot检测NMⅡA在上述细胞的的表达水平；最终根据其表达水平，选取胃癌细胞系SGC-7901和MGC-803作为后续研究的细胞模型。
　　2.利用RNAi干扰技术，转染胃癌细胞，并利用Real-time PCR和Western blot分别验证转染的有效性。
　　3.利用MTT实验观察改变NMⅡA的表达对SGC-7901和MGC-803细胞体外增殖能力的影响。
　　4.利用细胞划痕和Transwell迁移和侵袭实验研究在SGC-7901和MGC-803细胞中，NMⅡA对胃癌细胞的迁移和侵袭的影响。
　　结果：
　　1.NMⅡA在胃癌细胞系 SGC7901、AGS、BGC823、MKN28和MGC803中的表达水平明显高于对照组的 GES-1细胞；NMⅡA在SGC7901和MGC803的表达量较高。
　　2.MTT结果显示，下调NMⅡA的表达可降低SGC7901和MGC803细胞的体外增殖能力。
　　3.划痕实验以及Transwell迁移和侵袭实验结果显示，下调NMⅡA的表达可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。
　　第三部分、降低NMⅡA的表达对胃癌细胞中JNK/c-Jun信号通路的影响
　　方法：
　　1.利用 Western blot检测NMⅡA在胃癌细胞中JNK/c-Jun信号通路的影响。
　　2.加入茴香霉素，检测JNK信号通路相关蛋白的表达水平。
　　3.使用RNAi干扰在NMⅡA低表达的胃癌细胞中，利用划痕和Transwell迁移和侵袭实验，进一步研究茴香霉素对胃癌细胞的迁移和侵袭的影响。
　　结果：
　　1.干扰NMⅡA的表达可明显降低低胃癌细胞SGC7901中JNK和c-Jun磷酸化的表达水平。
　　2.在NMⅡA低表达的胃癌细胞中，茴香霉素可以增强JNK和c-Jun的磷酸化水平。
　　3.在NMⅡA低表达的胃癌细胞中，划痕实验以及Transwell迁移和侵袭实验结果显示，茴香霉素可以促进胃癌细胞的迁移和侵袭。
　　结论：
　　1.NMⅡA在胃癌组织和胃癌细胞中高表达；NMⅡA在高深度浸润、高TNM分期和有转移淋巴结的胃癌病例中的表达水平较相应对照组高。
　　2.NMⅡA参与调控胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等过程，有一定的促进作用。下调NMⅡA的表达可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。
　　3.NMⅡA在对胃癌细胞中通过JNK/c-Jun信号通路来调控胃癌细胞的迁移与侵袭。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

中英文缩写索引

引言

第一部分 NMⅡA在胃癌组织中的表达和临床意义

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 NMⅡA对胃癌细胞恶性生物学行为的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 降低NMⅡA的表达对胃癌细胞中JNK/c-Jun信号通路的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文结论

综述:非肌细胞肌球蛋白Ⅱ的研究进展

个人简历及读博期间发表的论文

个人简历

在读期间发表论文：

致谢