FAM46A，EBF1和PTPN22基因多态性与河南汉族肺结核相关性分析

摘要

研究背景和目的：
　　肺结核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染而引起的一种传染病，其感染率和致死率均较高，严重威胁了人类的健康。据统计，全球目前约有20亿人感染结核分枝杆菌，其中1/10的人发展为活动性结核。WHO的统计数据表明，全球有22个结核病高负担国家，我国是其中之一，结核病死亡率在各种死因中位列第9。
　　肺结核的发病机制非常复杂，除了受病原体毒力和环境因素的影响外，其发生还与宿主遗传基因有关。肺结核的遗传易患性由多种基因决定，而且因种族和地域的差异有所区别，所以临床上应针对不同的群体制定预防、诊断和治疗方案。因此，筛选不同地域和人群的肺结核易感基因，并探索其发病的分子机制，将为制定有针对性的预防、诊断和治疗方案提供理论依据和参考数据。
　　近年来，随着人类基因组学和蛋白组学的发展，已经发现有多种基因与肺结核的易感性相关。
　　2002年，Lagali,P.S等人首次发现位于染色体6q14.1的FAM46A基因，其编码序列第2外显子处存在一个VNTR序列。2014年，Godfrey Essien Etokebe等人发现，FAM46A基因与在克罗地亚人群肺结核易感性相关，并认为 VNTR可以参与调控形态发育，基因转录以及蛋白质的功能等生物过程，但在其他人群中未见相关报道。
　　早期B细胞因子1(EBF1)基因位于染色体5q34，是编码B细胞特异性因子，2012年，Eileen Png等人研究发现，EBF1基因rs10515787位点多态性与印第安人群的肺结核易感性相关，由于机体对结核分枝杆菌产生的免疫反应主要与 T淋巴细胞有关，所以作者推断该基因不仅参与 B细胞免疫，而且通过 NOTCH信号传导在 T细胞定向分化中亦扮演着非常重要的角色，影响宿主对胞内菌感染产生的免疫反应，但这一论点缺少更多的实验支持，Eileen Png的研究结果是种族遗传差异还是普遍现象？在中国人群中是否也存在这一发病机制？有待进一步的研究。
　　多项研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22基因（PTPN22）与多种免疫性疾病有关。该基因定位于1号染色体短臂1区3带，编码蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)， LYP可以抑制T细胞活化，限制T细胞活化的信号通路，引起相关疾病。近年来，有学者发现PTPN22基因rs2488457位点与I型糖尿病、自发性荨麻疹等免疫性疾病有关。2009年，Lamsyah等研究发现PTPN22基因rs33996649位点与摩洛哥人群肺结核的易感性有关。那么PTPN22基因rs2488457位点是否与肺结核的易感性相关？PTPN22基因 rs33996649位点是否与中国汉族人群肺结核的发生有关？这还有待进一步的研究。
　　本次实验选取FAM46A基因的VNTR位点，EBF1基因的rs10515787位点及PTPN22基因rs2488457和rs33996649位点，通过分析这四个位点多态性与河南汉族人群肺结核易感性的相关性，探索以上几个位点是否具有种族和地域的差异，为制定有效的PTB预防、诊断和治疗方法提供一定的参考和理论依据。
　　研究对象：
　　病例组：收集200例来自河南安阳和新乡传染病医院的初诊肺结核患者的血液标本，年龄范围在20-56之间，平均年龄为38.9±17.6岁，其中男性受试者146人，女性受试者54人，肺结核的诊断标准与2008年我国卫生部制定的WS288-2008诊断标准一致。排除其它免疫性疾病感染，如糖尿病、HIV感染等，以及使用免疫抑制剂的患者。
　　对照组：随机选取200名同期体检的健康个体，年龄范围在20-52岁之间，平均年龄为36.0±15.7岁，其中男性受试者178人，女性受试者22人，排除标准同病例组。
　　所有病例组和对照组的研究对象均来自河南地区，研究对象之间无血缘关系。以上所有受检个体均得到本人或监护人知情同意。
　　研究方法：
　　抽取研究对象2ml的外周血，酚-氯仿法提取基因组DNA。STR-PCR方法扩增FAM46A基因VNTR位点，扩增片段用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用毛细管电泳（CE）检测其多态性，并分别用其重复次数来命名VNTR的等位基因类型。PCR扩增 EBF1基因 rs10515787， PTPN22基因 rs2488457和rs33996649等位点，扩增片段用2.0%的琼脂糖凝胶一并进行电泳检测，然后分别经过TasⅠ、SacⅠ和MspⅠ限制性内切酶酶切，并分别用2.0%、3.5%和2.0%的琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行基因型检测，紫外分析凝胶成像系统观察并记录。
　　统计学处理：
　　使用SPSS17.0统计软件分析实验数据（检验水准：α=0.05），并根据运行结果，以OR值及95%置信区间来评估基因突变对肺结核发生的相对风险度。各位点对照组均使用HWE1.20软件进行Hardy-Weinberg检测，评估所选资料的人群代表性。运用MDR Software程序包（版本0.6.1）分析基因-基因间的交互作用。
　　结果：
　　1、对照组中，所检测的四个基因位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），具有较好的人群代表性。
　　2、FAM46A基因VNTR检测出4种等位基因，分别为1、2、3、4；检测到9种基因型，分别为1/1、1/2、2/2、1/3、2/3、3/3、2/4、3/4、4/4。相对风险估计显示2/2基因型与河南汉族肺结核的易感性呈正相关，2/3基因型与肺结核的易感性呈负相关。
　　3、EBF1基因rs10515787位点，在患者组和对照组之间，等位基因和基因型频率的差异均具有统计学意义（P＜0.05），AA基因型以及A等位基因是肺结核的发病危险因子。
　　4、PTPN22基因rs2488457位点GC基因型频率在两组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），相对风险估计显示与河南汉族肺结核的易感性呈负相关。
　　5、在河南汉族人群中未发现PTPN22基因rs33996649位点多态性，对所有受试个体的检测结果全部为CC基因型。
　　6、EBF1基因rs10515787位点、PTPN22基因rs2488457和rs33996649位点之间存在交互作用。
　　结论：
　　1、FAM46A基因VNTR位点、EBF1基因rs10515787位点G/A多态性、PTPN22基因rs2488457位点G/C多态性与肺结核的易感性有关。
　　2、EBF1基因rs10515787位点、PTPN22基因rs2488457和rs33996649位点之间存在交互作用。

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前言

实验材料

1 研究对象

2 试剂与器材

实验方法

1 提取基因组DNA

2 测定DNA纯度及含量

3 FAM46A基因VNTR位点，EBF1基因rs10515787位点，及PTPN22基因rs2488457和rs33996649位点的多态性检测

统计学分析

结果

1 四个位点基因分型结果

2 四个位点PCR产物测序结果

3 各基因多态分布的Hardy-Weinberg检验结果

4 病例组与对照组中各位点等位基因和基因型分布

5 应用多因子降维法（MDR）分析基因-基因交互作用

讨论

1 FAM46A基因VNTR位点与肺结核的易感性

2 EBF1基因rs10515787位点与肺结核的易感性

3 PTPN22基因rs2488457位点与肺结核的易感性

4 PTPN22基因rs33996649位点与肺结核的易感性

5 基因-基因之间的相互作用

结论

参考文献

综述:肺结核易感性相关基因的研究概况

1 HLA基因多态性与肺结核易感性的关系

2 非HLA基因多态性与肺结核易感性的关系

3 肺结核相关基因研究的现状及前景

参考文献

缩略词

致谢

个人简历