选择性COX-2抑制剂替泊沙林在大鼠脊髓胶质细胞激活和神经病理性疼痛中的作用

摘要

目的:大量的研究表明神经胶质细胞可以诱导神经病理性疼痛状态的发生和维持。神经胶质细胞在静息状态下几乎不表达或仅少量表达COX-2，但在细胞因子和脂多糖(LPS)等致炎物质刺激下，小胶质细胞中的COX-2mRNA与蛋白表达水平迅速升高，同时小胶质细胞被激活发生形态学变化，并释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1、白细胞介素-6和NO等神经毒性物质，损伤神经元。星形胶质细胞中COX-1的表达基本不变，而COX-2的表达增加。这说明COX-2和神经胶质细胞在神经系统炎症反应中起重要作用。但有关COX-2抑制剂对神经痛中胶质细胞的激活及对疼痛行为的影响，相关报道尚很少。本研究拟用脊神经高位结扎(SNL)神经痛模型大鼠，运用行为学测定方法和免疫荧光染色技术检测COX-2抑制剂替泊沙林对疼痛行为的影响及对小胶质细胞和星形胶质细胞激活的影响。评估选择性COX-2抑制剂替泊沙林在脊神经结扎模型大鼠中对脊髓胶质细胞和神经病理性疼痛的抑制作用。
　　方法:
　　实验一:制作SNL神经痛模型大鼠，测量大鼠脊神经结扎后3-21天的机械缩足阈值，评估大鼠机械性疼痛行为随时间变化规律。雄性SD大鼠20只，随机分为两组，假手术组和手术组。用von Frey Filament连续测定大鼠疼痛阈值的经时变化过程，以50％缩足阈值表示，绘制机械痛阈值经时变化曲线。
　　实验二:单次灌服替泊沙林后大鼠机械缩足阈值变化。健康无痛觉过敏痛觉迟钝雄性SD大鼠40只，L5脊神经结扎手术后随机分为5组，分组情况为:(1)CMC组:0.5％羧甲基纤维素钠(20ml/kg)，为阴性对照组;(2)双氯芬酸钠组:2.58mg/kg的双氯芬酸钠，为阳性对照组;(3)替泊沙林低、中、高剂量组(0.78mg/kg、1.56mg/kg及3.12mg/kg)，为试药组。术后第4天单次灌服给药，用von FreyFilament测定给药1小时后大鼠机械痛阈值变化情况。
　　实验三:替泊沙林对神经病理性疼痛早期大鼠机械性疼痛的抑制作用及对神经胶质细胞激活的影响。选取健康无痛觉过敏痛觉迟钝雄性SD大鼠18只，L5脊神经结扎手术后随机分为3组，分组情况为(1) CMC组:0.5％羧甲基纤维素钠(20ml/kg)，为阴性对照组;(2)双氯芬酸钠组:2.58mg/kg的双氯芬酸钠，为阳性对照组;(3)替泊沙林组:3.12mg/kg替泊沙林。SNL术前1h灌服给药，每天一次，持续至术后第7天，于手术后第3天至第7天进行机械痛阈值测定，并用免疫荧光法检测脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞激活情况。
　　实验四:替泊沙林对神经病理性疼痛后期大鼠机械性疼痛的抑制作用及对神经胶质细胞激活的影响。选取健康无痛觉过敏痛觉迟钝雄性SD大鼠18只，分组情况同实验三。在脊神经结扎15天后开始连续灌服给药，每天一次，持续至术后第20天，于手术后第15天至第20天进行机械痛阈值测定，并用免疫荧光法检测神经小胶质细胞和星形胶质细胞的激活情况。
　　结果
　　1.SNL脊神经结扎后机械性疼痛阈值经时变化曲线
　　SNL脊神经结扎后第3天疼痛阈值开始降低，此后一直波动于5g左右。术后第16天开始，疼痛阈值逐渐上升，直至术后第21天，但和假手术组相比，术侧缩足阈值仍显著降低，术后第3天到第15天，疼痛阈值维持一个较稳定水平。
　　2.单次灌服替泊沙林后机械缩足阈值变化
　　灌服替泊沙林显著提高大鼠机械缩足阈值。CMC对照组、双氯芬酸钠组和替泊沙林0.78、1.56、3.12mg/kg组的机械缩足阈值给药前分别是4.07±1.69g、4.01±0.26g、3.91±0.77g、3.97±1.2g、4.15±1.06g，给药1小时后分别为4.25±1.05g、10.85±1.86g、6.2±0.77g、8.08±1.47g、11.15±1.02g。替泊沙林高剂量组和CMC对照组对比机械痛阈值明显增加，且替泊沙林中、高剂量组和替泊沙林低剂量组对比机械痛阈值明显增加(分别为P＜0.05和P＜0.01);替泊沙林高剂量组和双氯芬酸钠组对比无显著性差异。
　　3.SNL脊神经结扎前后连续灌服替泊沙林7天对大鼠机械缩足阈值变化及对GFAP和OX-42的表达的影响
　　术前1h开始第一次给药，术后第1-7天连续灌服给药，结果表明替泊沙林能够抑制机械性疼痛的发展，SNL脊神经结扎第3天CMC对照组、双氯芬酸钠组和替泊沙林(3.12mg/kg)组机械缩足阈值分别为3.12±1.76g、10.85±1.52g、10.42±2.47g，第5天CMC对照组、双氯芬酸钠组和替泊沙林(3.12mg/kg)组机械缩足阈值分别为3.66±0.26g、11.63±0.66g、12.87±0.51g，第7天CMC对照组、双氯芬酸钠组和替泊沙林(3.12mg/kg)组机械缩足阈值分别为3.33±0.73g、12.67±0.29g、12.74±0.65g.由此可知，连续灌服替泊沙林在第3天、第5天、第7天均能有效抑制机械痛阈值(P＜0.01)，和双氯芬酸钠相比，无显著性差异。
　　免疫荧光染色结果显示，脊神经结扎可以诱导脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，且这种激活可以被术前预先连续灌服替泊沙林抑制。SNL脊神经结扎后小胶质细胞的标志物OX-42免疫荧光染色强度统计分析结果表明，与CMC对照组相比，第3天和第7天的光密度值(IOD)显著降低（分别为P＜0.01和P＜0.05）;星形胶质细胞的标志物GFAP免疫荧光染色强度统计分析结果表明，与CMC对照组相比，第3天和第7天的光密度值(IOD)显著降低。
　　4.SNL脊神经结扎15天后连续灌服替泊沙林后机械缩足阈值变化及GFAP和OX-42的表达情况
　　脊神经结扎15天后灌服替泊沙林能够抑制机械性疼痛行为，但是没有抑制脊髓神经胶质细胞的激活。SNL脊神经结扎第15天，CMC对照组、双氯芬酸钠组和替泊沙林(3.12mg/kg)组机械缩足阈值分别为5.57±1.65g、11.4±1.77g、10.06±1.5g，第17天CMC对照组、双氯芬酸钠组和替泊沙林(3.12mg/kg)组机械缩足阈值分别为6.91±1.82g、10.9±1.9g、11.38±0.96g,第20天CMC对照组、双氯芬酸钠组和替泊沙林(3.12mg/kg)组机械缩足阈值分别为7.9±0.7g、11.66±0.61g、11.84±0.84g。脊神经结扎20天后免疫荧光染色结果显示，和CMC对照组相比，OX-42标记的小胶质细胞和GFAP标记的星形胶质细胞并没有显著变化。提示替泊沙林并没有抑制神经病理性疼痛后期脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。
　　结论:
　　1.选择性COX-2抑制剂替泊沙林可剂量依赖性地抑制由大鼠脊神经结扎所引起的机械性疼痛行为;
　　2.脊髓COX-2介导的神经胶质细胞的激活在神经病理性疼痛的早期起着重要作用。

目录

声明

摘要

中英文对照缩略词表

前言

1 材料和方法

1．1 实验动物

1．2 药品及试剂

1．3 主要仪器

1．4 主要试剂配制

2 试验方法

2．1 制作大鼠神经痛模型

2．2 大鼠机械性疼痛行为测试

2．3 大鼠灌流取材

2．4 组织包埋

2．5 冰冻切片

2．6 免疫荧光染色

2．7 荧光染色分析

3 给药方案

3．1：单次灌服替泊沙林对神经病理性疼痛的作用

3．2：SNL脊神经结扎术前后连续灌服替泊沙林对神经病理性疼痛的抑制作用及对神经胶质细胞激活的影响

3．3：替泊沙林对神经痛后期大鼠机械性疼痛的抑制作用及对神经胶质细胞激活的影响

4 统计学处理

5 结果

5．1 大鼠手术前后疼痛行为经时变化过程

5．2 单次灌服替泊沙林后机械缩足阈值变化

5．3 SNL脊神经结扎术前后连续灌服替泊沙林对神经病理性疼痛的抑制作用及对神经胶质细胞激活的影响

5．4 替泊沙林对神经痛后期大鼠机械性疼痛的抑制作用及对神经胶质细胞激活的影响

6 讨论

7 结论

参考文献

综述 COX-2与神经病理性疼痛

附图

致谢