番茄红素环化酶基因在烟草类胡萝卜素合成中的作用研究

摘要

随着环境的日益恶化，水资源紧缺以及土壤盐碱化成为了世界性的问题，培育抗逆的植物品种已成为农业生产的当务之急。类胡萝卜素是植物体内一种重要的色素，作为植物光合系统和抗氧化系统的重要成员，在植物生长发育和抵御逆境的过程中起着重要的作用。番茄红素环化酶，包括ε番茄红素环化酶和β番茄红素环化酶，它们位于高等植物类胡萝卜素合成通路的分支点上，是类胡萝卜素合成的关键酶，催化番茄红素向α或β类胡萝卜素的转化。
　　本文分别对烟草中ε番茄红素环化酶和β番茄红素环化酶基因进行克隆，并对其遗传背景和表达模式进行分析，利用病毒诱导基因沉默（VIGS）和转基因技术对两个基因在类胡萝卜素合成及抗逆中的作用进行了详细的研究，主要研究内容如下：
　　（1）采用同源克隆的方法得到普通烟草Ntε-LCY基因，设计跨内含子保守引物从烟草DNA组中进行PCR扩增，采用凝胶电泳和毛细管电泳技术对PCR产物进行分离分析，发现普通烟草基因组内存在两个Ntε-LCY基因拷贝，命名为Ntε-LCY1和Ntε-LCY2；遗传进化分析结果表明Ntε-LCY1和Ntε-LCY2分别来源于林烟草和绒毛状烟草，两个基因编码区核酸序列相似度高达97％，氨基酸序列高达95%。基因表达模式分析结果显示 Ntε-LCY基因在各个组织器官中都有表达，但在叶中表达量最高，而且该基因受低温弱光条件诱导表达。亚细胞定位结果显示 Ntε-LCY1成熟蛋白定位在叶绿体中。利用 VIGS在本氏烟草中对ε-LCY基因功能进行了初步研究，利用HPLC-UV对烟草代谢物类胡萝卜素进行分离检测，发现ε-LCY基因的表达抑制增加了β-分支类胡萝卜素的含量，降低了α分支类胡萝卜素的含量，烟草体内类胡萝卜素合成相关基因的表达量也显著提高，同时改善了烟草对光抑制的抵御能力。借助转基因技术通过RNA干扰（RNAi）和过量表达烟草中的Ntε-LCY基因，进一步的研究了Ntε-LCY在植物中的生理功能。在Ntε-LCY RNAi植株中提高了类胡萝卜素合成相关基因的表达量和β分支类胡萝卜素的含量。在盐和干旱胁迫条件下，Ntε-LCY RNAi转基因植株具有较高的相对含水量和较少的活性氧含量。利用UPLC-MS/MS对胁迫前后Ntε-LCY RNAi转基因及对照烟草中ABA含量进行分析，发现转基因烟株中具有较高的ABA含量，充分说明Ntε-LCY表达抑制显著提高了植物对高盐和干旱的适应能力。相反地Ntε-LCY过量表达则降低了烟株的抗盐抗旱能力。
　　（2）采用同源克隆的方法从普通烟草中克隆得到Ntβ-LCY基因，并分析了其遗传背景，烟草 Ntβ-LCY基因与茄科植物的蛋白相似度高达89%以上，与模式植物拟南芥相似度高达77%，且与祖先种烟草绒毛烟草氨基酸序列相似性高达99.8%，表明β-LCY基因是一个进化较为保守的基因，同时也推断克隆的Ntβ-LCY基因可能来源于绒毛状烟草。表达模式分析结果表明该基因在烟株生理作用比较旺盛的嫩叶中具有较高的表达量，且易于受植物激素和逆境诱导表达。亚细胞定位显示该蛋白定位在叶绿体中。利用烟草脆裂病毒（TRV）介导的病毒诱导基因沉默技术，初步探讨了烟草β-LCY基因生物学功能，烟草中β-LCY基因表达抑制，使烟草叶片严重黄化，植株生长发育不良，矮化明显，类胡萝卜素及叶绿素含量急剧减少，并导致光合作用能力下降。由于β-LCY沉默导致显著的表型特征，所以该研究为TRV VIGS提供了良好的可选参照基因。通过转基因技术，利用RNA干扰和过量表达的方法，进一步研究该基因的生物学功能。在Ntβ-LCY RNAi转基因烟草中，Ntβ-LCY基因的沉默使烟草出现严重的白化现象，严重者则会在苗期逐渐死亡。定量PCR及代谢分析结果显示，Ntβ-LCY基因的表达抑制严重的影响了类胡萝卜素合成相关基因的转录表达和类胡萝卜素物质的正常合成，并且影响了信号分子ABA的合成，显著降低了植物抵御逆境的能力。过量表达Ntβ-LCY基因，转基因烟草没有明显的可视表型，定量PCR和代谢结果表明，该基因的过量表达提高了类胡萝卜素合成相关基因的表达和类胡萝卜素及叶绿素含量。在盐和干旱逆境胁迫条件下，Ntβ-LCY过表达转基因烟草能保持较高的体内水含量，有效的消除逆境胁迫产生的过量的活性氧，保护了植株，显著提高了烟草的抗逆能力。

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第1章 绪论

1.1 植物的非生物胁迫

1.2 植物抗逆的分子机制

1.3 类胡萝卜素

1.4 植物基因功能研究策略

1.5 植物代谢物分离及定量检测

1.6 本论文选题背景、目的及意义

第2章 普通烟草中Ntε-LCY基因的克隆及表达模式分析

2.1 引言

2.2 实验材料、仪器和试剂

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 小结

第3章 病毒诱导基因沉默对烟草ε-LCY基因功能的初步分析

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.3 结果和分析

3.4 小结

第4章 转基因烟草中Ntε-LCY基因功能研究及在抗逆中的应用

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.3 结果和分析

4.4 小结

第5章 普通烟草中Ntβ-LCY基因的克隆及表达模式分析

5.1 引言

5.2 实验仪器、材料和试剂

5.3 实验方法

5.4 结果与分析

5.5 小结

第6章 病毒诱导基因沉默对烟草β-LCY基因功能的初步分析

6.1 引言

6.2 材料和方法

6.3 结果和分析

6.4 小结

第7章 转基因烟草中Ntβ-LCY基因功能研究及在抗逆中的应用

7.1 引言

7.2 材料和方法

7.3 结果和分析

7.4 小结

第8章 结论与展望

8.1 结论

8.2 展望

参考文献

个人简历

致谢