柑橘果实类胡萝卜素代谢及番茄红素环化酶重组蛋白的表达鉴定

摘要

柑橘果实富含多种类胡萝卜素成分，而番茄红素环化酶抑制剂处理是研究柑橘果实类胡萝卜素代谢的有效手段。本文以纽荷尔脐橙（Citrus sinensis Osbeck cv. Newhall）、伏令夏橙（C. sinensis Osbeck cv. Valencia）、日南一号温州蜜柑（C. unshiu Marcow cv. Nichinan1）和国庆一号温州蜜柑（C. unshiu Marcow cv. Guoqing1）为试验材料，研究了番茄红素环化酶抑制剂2-(4-硫代氯苯)-三乙胺盐酸盐（CPTA）和2-(4-甲基苯氧)-三乙胺盐酸盐（MPTA）对柑橘果实等的处理效果以及CPTA对伏令夏橙黄皮层中番茄红素等类胡萝卜素组分含量及八氢番茄红素合成酶（PSY）等基因表达量的影响，探讨了CPTA对类胡萝卜素生物合成的调控机制，并通过蛋白质组学方法初步鉴定了伏令夏橙黄皮层中响应CPTA处理的蛋白质。此外，本研究还克隆了柑橘果实番茄红素环化酶基因LCYe和LCYb并分别构建了其巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）融合表达载体，用甲醇诱导表达后分别对这两个重组蛋白质进行了纯化鉴定。主要研究结果如下：
　　（1）番茄红素环化酶抑制剂CPTA和MPTA对柑橘果实等的处理效果。果皮涂抹结果表明，0.1%～5%CPTA或MPTA可诱导柑橘果皮组织大量积累番茄红素并呈现红色，但并不改变果皮油胞点的超微结构，且基本不影响果肉着色及可溶性糖等常规品质指标；相反，伏令夏橙果实经0.1%CPTA中柱注射处理后果皮着色不受影响，而汁胞柄、中柱组织及相邻的囊衣和白皮层组织均明显变为红色。日南一号温州蜜柑在果皮转色后经0.1%CPTA处理5 d即可达到较均一稳定的处理效果，而转色前经0.5%CPTA处理20 d仅仅是油胞点变红，表明选择类胡萝卜素已大量合成时（果皮转色后）进行番茄红素环化酶抑制剂处理是关键。此外，0.1%CPTA喷雾处理5 d即可诱导白色花蕾变为粉红色，而0.1%CPTA和MPTA处理均基本不影响叶片颜色，说明在同等浓度水平处理条件下，花蕾和果皮等类胡萝卜素代谢旺盛的器官或组织着色对CPTA诱导较敏感。
　　（2）CPTA对伏令夏橙黄皮层类胡萝卜素代谢的影响。田间条件下5% CPTA处理结果表明，黄皮层中番茄红素的快速、持续积累是其类胡萝卜素代谢最显著的变化。伏令夏橙黄皮层中通常检测不到番茄红素，然而经CPTA处理2 d后就检测到了较高浓度的番茄红素（1.57μg/g FW），30 d后其含量则高达23.58μg/g FW；两个下游环化分支中的类胡萝卜素合成均受到了抑制，且总体上受抑制程度相似。实时荧光定量PCR结果表明，两个番茄红素环化酶基因LCYe和LCYb的表达均未受到抑制，而其上游基因PSY、PDS和ZDS的变化趋势基本一致，处理8 d内均逐渐上调表达，与番茄红素的快速积累均显著正相关（P<0.05）。
　　（3）CPTA对伏令夏橙黄皮层蛋白质组的影响。通过2-DE凝胶图像分析鉴定出了49个在 CPTA处理样品和黄皮层对照样品间差异表达的蛋白点，提交MALDI-TOF/TOF质谱鉴定的35个差异表达蛋白点中有33个匹配到了合乎标准的蛋白质，其中76%的最佳匹配结果为柑橘属植物蛋白，但并不包括番茄红素环化酶LCYe和LCYb，由此推测CPTA处理的抑制靶点可能是番茄红素环化酶的酶活性，而不是其mRNA转录水平或者蛋白质表达水平。鉴定出的33个蛋白质根据其生物学功能可归为8大类，其中碳/能量代谢和核酸代谢相关蛋白占61%，而属于类胡萝卜素生物合成途径的只有类胡萝卜素异构酶（CRTISO）。
　　（4）番茄红素环化酶重组蛋白的表达与鉴定。基因克隆测序结果表明，纽荷尔脐橙番茄红素环化酶基因LCYe和LCYb的开放读码框（ORF）分别为1590 bp和1515 bp，分别编码529和504个氨基酸。在此基础上分别构建了其分泌型毕赤酵母融合表达载体并转化X-33酵母菌株进行甲醇诱导表达，相关蛋白组分经His标签纯化后通过SDS-PAGE和Western blot分析进行了初步鉴定，结果未检测到目标重组蛋白。推测其主要原因可能是两重组蛋白的表达量过低。

目录

声明

缩略语表

第1章 前 言

1.1 课题的提出

1.2 类胡萝卜素研究进展

1.3 番茄红素环化酶研究进展

1.4 植物蛋白质组学研究概况

1.5 巴斯德毕赤酵母表达系统研究概况

1.6 本研究内容、目的和意义

第2章 番茄红素环化酶抑制剂筛选及其应用效果

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第3章 CPTA对伏令夏橙黄皮层类胡萝卜素代谢的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第4章 CPTA对伏令夏橙黄皮层蛋白质组的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第5章 番茄红素环化酶重组蛋白的表达与鉴定

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

结论与展望

参考文献

致谢

附录Ⅰ：课题资助项目

附录Ⅱ：已发表的文章

附录Ⅲ：参加学术会议