let-7a和长链非编码RNAH19在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

摘要

背景与目的：
　　食管癌是一种严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，在世界范围内发病率呈上升的趋势。它的预后极差，即使是接受手术的患者也有90％会复发转移，因此，食管癌的诊断极其重要。食管癌主要分为鳞癌和腺癌两类，我国食管癌发病的主要类型是食管鳞状细胞癌（ESCC）。
　　非编码RNA（ncRNA）是一类不编码蛋白的RNA，根据非编码RNA片段的长度可以将其分为短链非编码RNA（如siRNA、piRNA和microRNA等）和长链非编码RNA（lncRNA）。NcRNAs几乎在基因生命周期的每一个步骤中都有参与，从基因的转录到mRNA剪接，再到RNA的衰变和翻译。microRNA的组成是一类长度约为20-23 nt的非编码型小分子RNA。研究发现约半数以上的mRNAs受miRNAs的调控，同时一种microRNA也可以几百个目标基因的靶点。microRNAs作为基因的重要调控因子，microRNAs的失调也常见于各种疾病，包括肿瘤的形成、发展、转移及预后等。LncRNA是一类不能够编码蛋白质且转录长度超过200nt的RNA分子，它能够以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因的表达水平。已有证据表明lncRNAs不仅能够对哺乳动物的细胞具有转录调控作用，而且对于microRNAs也具有调节功能。
　　H19是长链非编码 RNA中的一种，于多种疾病中被研究，与microRNAs的表达密切相关。let-7则是最早发现的microRNAs的一员，于多种肿瘤表达下降，被认为是一种肿瘤抑制基因，let-7a是let-7家族的一种。然而let-7a和H19于ESCC中罕见报道。本实验拟对ESCC患者组织中H19和let-7a进行检测，研究ESCC组织中H19和let-7a的表达状况，其与临床病例因素的关系，以及两者之间的相关性，此外对血浆中let-7a进行检测分析，探讨其作为肿瘤标志物的可能性。
　　方法：
　　1.收集30例ESCC患者手术后的ESCC病变组织及对应癌旁正常食管粘膜组织，统计患者的基本信息及临床病理资料。采用2-ΔΔCT实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法检测癌组织和相对应癌旁正常组织中let-7a和H19的表达水平。
　　2.收集110例血浆标本，其中ESCC患者70例为实验组，健康体检者40例为对照组，统计受试者的基本信息及临床病理资料。采用2-ΔΔCT qRT-PCR方法检测血浆中实验组和对照组let-7a的表达水平。
　　3.采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析癌组织及癌旁组织中H19和let-7a的表达水平，评价其表达变化与ESCC患者临床病理因素之间的关系，以及let-7a与 H19之间的相关性，对血浆中 let-7a表达变化进行检测，分析其与ESCC患者临床病理因素之间的关系，并计算其作为肿瘤标志物的灵敏度和特异度。
　　结果：
　　1.和正常食管粘膜组织相比，let-7a在ESCC组织中相对表达量为0.79±1.10表达下降（P<0.05），H19在 ESCC组织中相对表达量为5.11±10.85表达升高（P<0.05）。
　　2.ESCC患者食管组织中let-7a在Ⅲ/Ⅳ期相对表达量（0.29）显著低于Ⅰ/Ⅱ期（0.55），差异有统计学意义（P<0.05），H19在临床病理分期Ⅲ/Ⅳ期相对表达量（3.26）显著高于Ⅰ/Ⅱ期（1.14），差异有统计学意义（P<0.05），let-7a和H19的表达与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移和组织学分级均无关。
　　3. ESCC组织中H19水平和let-7a成负相关，相关系数为0.867，P<0.05。
　　4.和对照组相比，let-7a在食管癌血浆中的相对表达量为0.53±0.43，表达量低于对照组（P<0.05），ROC曲线下面积为0.829（95%CI：0.754～0.904），当cut-off值设为6.22时，其灵敏度和特异性分别为74.3%和85.0%，临床病理分期Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期患者血浆let-7a相对表达量的中位数分别为0.42和0.24，差异有统计学意义，而与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移和组织学分级均无关。
　　结论：
　　ESCC患者组织中let-7a表达降低，H19表达升高，let-7a和H19的相对表达量与临床分期有一定相关性，且两者之间具有一定的相关性，说明let-7a和H19两者之间可能具有调控作用并在肿瘤的发生发展过程中有重要作用。此外，let-7a在血浆中表达下降并与与临床分期有一定相关性，且具有较高的灵敏度和特异度，提示let-7a能成为潜在的肿瘤标志物。

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中英文缩略词表

引言

材料与方法

1 材料

1.1 引物及内参设计

1.2 总RNA提取试剂及qRT-PCR相关试剂

1.3 主要仪器

1.4 主要试剂配制

1.5 PCR引物序列

2 实验方法

2.1 研究对象

2.2 标本的采集及保存

2.3 血浆及组织总RNA提取

2.4 Real-Time PCR扩增体系

2.5 相对量表达

2.6 统计学处理

结果

1 所提取总RNA完整性及纯度测定

2 let-7a和H19的扩增曲线

3 ESCC患者食管组织中let-7a和H19的表达水平及相关性分析

4 ESCC患者组织let-7a和H19表达水平与临床病理特征的关系

5 ESCC患者血浆let-7a的表达水平和诊断价值

讨论

1 非编码RNA与肿瘤

2 let-7的生物学作用

3 H19的生物学作用

结论

参考文献

综述: microRNAs在食管癌中的研究进展

个人简历、在校期间发表的学术论文与研究成果

致谢