一氧化氮与胰岛素抵抗大鼠脑细胞凋亡间的关系

摘要

研究背景:随着医疗技术的进步、生育率的下降，我国已步入老龄化社会，脑血管疾病、脑神经退行性病变的发生率逐年升高。脑血管疾病在我国已处于首位致死原因，给个人、家庭及社会带来了沉重的负担。而合并有代谢综合征（Metabolic Syndrome,MS）的人群逐年增加。MS是多种代谢因素发生异常，聚集于同一个体的临床综合征，易并发糖尿病及心脑血管疾病。它的发病率在中国已经超过14％。
　　研究发现，脑血管意外、神经退行性病变、急性脑损伤及癫痫等均存在神经细胞凋亡（apoptosis）现象。致凋亡因素有很多种，体内外研究发现，过多的一氧化氮也是其中一种致凋亡因子。单硝酸异山梨酯，作为一种外源性一氧化氮供体，广泛应用于合并有代谢综合征的心血管疾病患者。但它是否有促进大脑细胞凋亡作用及其机制尚不清楚。
　　本实验用Wistar大鼠模型，利用单硝酸异山梨酯作为一氧化氮供体，观察大鼠脑细胞凋亡情况，检测脑细胞凋亡基因、抗凋亡基因及其蛋白的表达情况，从分子水平上探讨单硝酸异山梨酯是如何促进合并有胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）大鼠的脑细胞凋亡的，并帮助寻找有效作用靶点，为治疗与脑细胞凋亡有关疾病提供了一条新的途径。
　　材料和方法:
　　1.分组及饲喂方法
　　14周龄Wistar雄性大鼠40只，体质量（393.75±11.09）g，各组大鼠之间体重差异无统计学意义。适应性喂养7天后，随机分为4组，每组10只，分别饲喂普通饲料（对照组，Control组），高脂高糖饮食(HFHG组)，普通饲料和单硝酸异山梨酯（ISMN组），以及同时给予HFHG和ISMN（联合喂养组，UNITED组）。其中，ISMN按4.2mg/Kg剂量灌胃,不给予ISMN的大鼠使用生理盐水灌胃。HFHG配方为：普通饲料79％，蔗糖10%，猪油5％，胆固醇5％，石胆酸1%。上述方法喂养12周。
　　2.观察指标
　　（1）血标本用于检测血糖浓度（葡萄糖氧化酶法）及胰岛素含量（放射免疫法），以此计算胰岛素抵抗指数。
　　（2）采用硝酸还原酶法测定脑组织NO及iNOS含量。
　　（3）RT-PCR检测方法测定Bcl-2、Bax mRNA表达含量，Western blot检测方法测定Bcl-2、Bax蛋白表达含量。
　　（4）TUNEL法观察放入4%甲醛溶液中脑组织形态及凋亡细胞的数量。
　　结果:
　　1.HOMA-IR与Control组大鼠相比，添加单硝酸异山梨酯饮食、高脂高糖饮食大鼠及联合饮食大鼠HOMA-IR均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。（表1）
　　2.脑组织中NO含量
　　与Control组大鼠相比，HFHG组、ISMN组及UNITED组大鼠NO含量均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；UNITED组大鼠NO含量高于HFHG组、ISMN组大鼠，差异有统计学意义（P<0.05）。（表2）
　　3.脑组织中iNOS含量
　　与Control组大鼠相比，ISMN组、HFHG组及UNITED组大鼠iNOS含量均升高，差异有统计学意义（P<0.05）；UNITED组大鼠iNOS含量高于HFHG组、ISMN组大鼠，差异有统计学意义（P<0.05）。（表3）
　　4.HOMA-IR与NO含量的相关性分析
　　HFHG组大鼠组，NO含量与HOMA-IR呈正相关，r＝0.739，P<0.05。ISMN大鼠组，HOMA-IR与脑组织NO含量与呈显著正相关，r＝0.922，P<0.01。（图1）
　　5.各组大鼠脑细胞凋亡指数和脑组织形态学观察
　　TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测脑细胞凋亡光镜下可以观察到处于凋亡状态的细胞细胞核呈棕黄色，而正常的细胞细胞核不被染色。4组大鼠脑细胞均能观察到部分凋亡细胞，而ISMN组、HFHG组及UNITED组大鼠脑细胞凋亡增多，差异有统计学意义，P<0.05。（表4、图2）
　　6.各组大鼠脑组织Bcl-2、Bax mRNA与蛋白表达
　　与Control组大鼠相比，ISMN组、HFHG组及UNITED组大鼠Bcl-2 mRNA表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与Control组大鼠相比，ISMN组、HFHG组及UNITED组大鼠Bax mRNA表达水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。（表5、图3）
　　与Control组大鼠相比，ISMN组、HFHG组及UNITED组大鼠Bcl-2 mRNA蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与Control组大鼠相比，ISMN组、HFHG组及UNITED组大鼠Bax mRNA蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。（表6、图4）
　　结论:
　　1.给予高血糖和胰岛素抵抗大鼠单硝酸异山梨酯可增加脑组织中 NO含量;
　　2.脑组织中过多的NO可促进大鼠大脑细胞凋亡，而胰岛素抵抗会加重大脑细胞的凋亡；
　　3.NO与胰岛素抵抗相互诱导，共同作用于大鼠大脑细胞凋亡过程中；
　　4.NO可引起大脑细胞凋亡，其可能是与NO作用剂量及诱导酶种类不同有关。

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英文缩略词表

1 前言

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1 实验动物及实验环境

2.1.2 实验仪器

2.1.3 主要试剂

2.1.4 饲料配料

2.2方法

2.2.1 实验动物的选择、随机分组、喂养及给药

2.2.2 主要试剂配制

2.2.3 血生化相关指标检测

2.2.4 大鼠大脑组织NO及iNOS的检测方法

2.2.5 动物实验、标本取材及制备

2.2.6 TUNEL法检测凋亡细胞

2.2.7 RT-PCR检测BCL-2/Bax基因表达水平

2.2.8 Western blot检测BCL-2/Bax基因蛋白表达水平

2.3 统计方法学分析

3 结果

3.1 大鼠的一般状态

3.2. HOMA-IR

3.3 脑组织中NO含量

3.4 脑组织中iNOS含量

3.5 HFHG 组、ISMN 组大鼠HOMA-IR与脑组织NO含量的相关性分析

3.6 各组大鼠脑细胞凋亡指数和脑组织形态学观察

3.7 各组大鼠脑组织Bcl-2、Bax mRNA与蛋白表达

附图

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:脑血管疾病与胰岛素抵抗

个人简历：

教育经历：

致谢