赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及其噬菌体模拟表位的筛选

摘要

赭曲霉毒素（Ochratoxins）是由曲霉菌属（Aspergillus）和青霉菌属（Penicillium）的某些种产生的二级代谢产物，包含七种结构类似的化合物，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）最普遍且毒性最强。OTA具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、以及致畸、致癌和致突变等特性，对动物和人体健康有很大的潜在危害，国际癌症研究机构（IARC）于1993年将OTA列为2B类致癌物。目前，用于检测 OTA的高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、液相-质谱联用法（LC-MS）、荧光检测法等方法的样品前处理步骤繁琐、成本高、要求专业人员进行操作，不适合大批量样品的检测。酶联免疫分析法（ELISA）不仅具有较好的灵敏度和特异性，而且对检测样品纯度要求低，操作简单可行，适合大批量样品的检测。但是，酶联免疫分析法的竞争性检测是建立在酶标记毒素或载体偶联毒素作为竞争抗原基础上的有毒检测体系，而且还存在标品毒素昂贵、进口受限、偶联反应繁琐以及操作人员的身体健康受到威胁等缺点。噬菌体展示技术的出现有力的解决了这一难题。利用噬菌体展示技术通过淘选可以得到OTA的模拟表位，以无毒的模拟表位代替有毒的标品毒素用于毒素的检测当中，有效的解决了OTA毒性大、操作不便等问题，为实验人员的人身安全提供了保证。
　　本论文研究的主要内容如下：
　　1.赭曲霉毒素A完全抗原的合成与鉴定
　　采用活性酯法（NHS）将OTA分别与大分子载体即蛋白牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）进行连接，制备了免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA。紫外扫描和SDS-PAGE鉴定表明OTA与BSA、OTA与OVA偶联成功，偶联比分别为7:1和4.5:1。用制备的免疫原OTA-BSA免疫Bal b/c小鼠制备多克隆抗体，用制备的包被原OTA-OVA包被ELISA板进行检测，结果表明所制备的人工抗原具有很好的免疫原性，小鼠血清中抗OTA的抗体最高效价可达1:512000，为OTA单克隆抗体的制备奠定了基础。
　　2.赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备与鉴定
　　用制备的人工抗原OTA-BSA免疫6周龄Bal b/c小鼠，经四次免疫后，测定小鼠血清中抗OTA的抗体效价及其敏感性，选择免疫效果较好的小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，用间接ELISA和间接竞争ELISA进行筛选。经3次亚克隆后得到2株可以稳定分泌抗OTA的单克隆细胞株，分别命名为1B2和2G3。体内诱生腹水法制备单抗腹水，辛酸-硫酸铵法对其进行纯化。经ELISA方法鉴定表明：2株单克隆抗体的效价均可达10-6，IC50值分别为0.723ng/mL和0.683ng/mL，亲和力常数分别为3.05×1010L/moL和2.56×1011L/moL，经抗鼠单克隆抗体亚型试剂盒鉴定，2株单抗的亚型均为IgG1型。
　　3.赭曲霉毒素A模拟表位的亲和淘选
　　以纯化后的抗OTA单克隆抗体为靶标，亲和淘选噬菌体随机七肽库。共进行4轮淘选，在第4轮淘选的洗脱物滴度测定过程中，从总蓝斑数不到100的平板上挑取20个噬菌斑克隆，经间接ELISA和间接竞争ELISA确定阳性噬菌体克隆。将这些阳性克隆进行测序、分析和翻译，得出模拟表位的氨基酸序列。以单克隆抗体1B2为靶分子，所筛选出的模拟表位序列均为 TTQVLEA；以单克隆抗体2G3为靶分子的筛选中，得到了两种模拟表位序列，分别为VIGNSDP和QQSWLHI。

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1 文献综述

1.1 赭曲霉毒素A的简介

1.2 赭曲霉毒素A的理化性质和结构

1.3 赭曲霉毒素A的危害

1.4 赭曲霉毒素A的脱毒方法

1.5 赭曲霉毒素A的限量标准与检测方法

1.6 噬菌体展示技术的简介

1.7 噬菌体展示系统的类型与发展

1.8 噬菌体展示技术的应用

1.9 研究目的和意义

2 赭曲霉毒素A完全抗原的合成与鉴定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

3 抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

4 赭曲霉毒素A模拟表位的筛选

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

5 实验结论

参考文献

附录 英文缩写词汇表

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果