二甲双胍通过调节PR-B的表达改善孕激素耐药的子宫内膜癌细胞的耐药性

摘要

背景：
　　子宫内膜癌是世界范围内女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一。手术治疗仍然是子宫内膜癌的主要治疗方式，然而对于年轻的子宫内膜癌患者而言，治疗肿瘤的同时保留生育功能一直是患者的迫切要求，这是对传统子宫内膜癌的治疗方式的挑战。目前孕激素已经应用于要求保留生育能力的早期子宫内膜癌患者，但激素长期治疗的效果一直不太令人满意，长期激素治疗导致子宫内膜癌对孕激素耐药可能是治疗失败的根本原因。因此，如何改善孕激素的耐药，提高孕激素治疗子宫内膜癌的效果是目前临床治疗上亟待解决的一个问题。
　　目的：
　　通过细胞增殖实验（CCK-8）分析二甲双胍对子宫内膜癌孕激素耐药细胞增殖的影响；应用westernblot技术分析二甲双胍对子宫内膜癌孕激素耐药细胞中PR-B信号通路的调节作用，探讨二甲双胍对子宫内膜癌孕激素耐药细胞的调节作用及可能的作用机制，为改善孕激素耐药、延缓子宫内膜癌的进展及改善子宫内膜癌的预后提供一个新的思路。
　　方法：
　　1.在子宫内膜癌Ishikawa细胞的基础上，以醋酸甲羟孕酮（medroxyprogesterone17-acetate，MPA）为诱导剂，采用浓度逐步递增的方法持续给药，体外培养诱导建立子宫内膜癌孕激素耐药细胞（MPA-R-Ishikawa）。
　　2．采用CCK-8法分别研究不同浓度的二甲双胍和醋酸甲羟孕酮作用24h后Ishikawa细胞和MPA-R-Ishikawa细胞的增殖情况。
　　3．对于Ishikawa细胞和MPA-R-Ishikawa细胞分别做出以下四种处理：细胞中加入含20μmol/L的MPA培养基，记为MPA组；细胞中加入含20mmol/L的二甲双胍的培养基，记为二甲双胍组；细胞中加入含20μmol/L的MPA和20mmol/L的二甲双胍的培养基，记为MPA+二甲双胍组，细胞中加入不含任何药物的培养基，记为对照组。处理48小时后，采用蛋白印迹（westernblot）法检测四种条件下Ishikawa细胞和MPA-R-Ishikawa细胞中PR-B蛋白的表达情况。
　　4.应用SPSS17.0软件进行统计学分析。实验数据中计量资料以x±s表示，符合正态分布的两组独立数据间比较用t检验的方法。对于两组以上的计量资料而言符合正态分布的多组定量资料采用单因素方差分析（方差齐）和Kruskal-Wallis检验（方差不齐），采用最小显著差数（LSD）法-t检验进行组间的两两比较。如果数据不满足正态性分布的条件，则采用秩和检验的统计学方法。以α=0.05为检验水准，P<0.05时差异有统计学意义。
　　结果：
　　1．在Ishikawa细胞的基础上，利用醋酸甲羟孕酮为诱导剂,采用持续作用、浓度递增(l-15μmol/L)的方法,历经近1年的时间，成功地建立人子宫内膜癌孕激素耐药的细胞MPA-R-Ishikawa细胞。Ishikawa细胞和MPA-R-Ishikawa细胞的倍增时间分别是（47±3）h和（43±4）h，两者比较，倍增时间的差异无统计学意义（t=0.349，P=0.572）。
　　2．CCK-8法检测显示，不同浓度的MPA作用后，两种细胞增殖情况明显不同。MPA-R-Ishikawa细胞用低浓度（1、5μmol/L）的MPA处理24小时后，其增殖呈轻微的促进趋势，其增殖率分别为3％，13%；高浓度（10、20、40、60μmol/L）的MPA作用24小时后，MPA-R-Ishikawa细胞的增殖呈一定的抑制作用，其抑制率分别为4%、3%、9%、40%。而Ishikawa细胞接受不同浓度（1、5、10、20、40、60μmol/L）的MPA的作用24小时后，其增殖均呈显著的抑制趋势，其抑制率分别为16%、30%、41%、55%、65%、66%。在同一浓度下，两种细胞间抑制率的差异有统计学意义，χ2=17.29，P=0.000。另外，不同浓度的二甲双胍作用24小时后，两种细胞的增殖均明显受到抑制作用。二甲双胍的浓度分别设定为1、10、20、40、60、70、80mmol/L时，相应浓度作用下，MPA-R-Ishikawa细胞的抑制率分别为-10%、20%、56%、89%、97%、98%、99%。然而同时Ishikawa细胞的抑制率分别为-6%、19%、37%、54%、70%、72%、83%。随着浓度的增加，二甲双胍对Ishikawa细胞和MPA-R-Ishikawa细胞增殖的抑制作用越来越强（χ2=72.9，P=0.000；χ2=76.3，P=0.000）。
　　3．westernblot法检测显示，Ishikawa细胞中，与对照组比较，二甲双胍组，MPA+二甲双胍组的PR-B蛋白的表达水平增加，均高于对照组，且差异有统计学意义（F=112.97，P=0.000＜0.05）；MPA-R-Ishikawa细胞中，与对照组比较，二甲双胍组、MPA+二甲双胍组的PR-B蛋白的表达水平增加，均高于对照组，差异有统计学意义（F=598.64，P=0.000＜0.05）；两组间比较MPA-R-Ishikawa细胞对照组PR-B表达低于Ishikawa细胞对照组，差异有统计学意义（t=10.21，P=0.000＜0.05）。
　　结论：
　　二甲双胍能够调节对孕激素耐药的子宫内膜癌细胞的耐药性，其作用机制可能是二甲双胍提高了孕激素耐药的子宫内膜癌细胞中PR-B蛋白的表达水平，从而改善了孕激素耐药子宫内膜癌细胞的耐药性。

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引言

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 孕激素耐药子宫内膜癌细胞MPA-R-Ishikawa细胞和Ishikawa细胞的生长增殖情况的比较

2.2 不同浓度的MPA作用后MPA-R-Ishikawa细胞和Ishikawa细胞增殖情况的比较

2.3 不同浓度的二甲双胍作用后Ishikawa和MPA-R-Ishikawa细胞增殖情况的比较

2.4 MPA、二甲双胍作用后MPA-R-Ishikawa细胞和Ishikawa细胞中PR-B蛋白表达水平的比较

3 讨论

3.1 建立对孕激素耐药的子宫内膜癌细胞的理论依据

3.2 子宫内膜癌孕激素耐药的可能机制

3.3 二甲双胍对子宫内膜癌孕激素耐药性的影响

4 结论

5 展望

参考文献

综述: 二甲双胍对子宫内膜癌的作用及其相关的作用机制

个人简历

致谢