Modulation of efflux of xenobiotics in multidrug resistant (MDR) cancer cell lines by pluronic block copolymers = Effet des copolymères en bloc de la famille des pluronics® comme modulateur de l'efflux de xénobiotiques dans les lignées cellulaires cancéreuses exprimant un phénotype de résistance aux drogues multiples (mdr)

摘要

L'émergence de la résistance aux drogues multiples (Mufti Drug Resistance, MDR) médiée par la surexpression de plusieurs protéines liant 1'ATP (ATP-Binding Cassette, ABC) constitue un obstacle majeur qui limite souvent le succès des traitements ciblant certains cancers et autres maladies. Trois transporteurs ABC cliniquement représentatifs qui sont associés au MDR sont: la protéine de perméabilité (Permeability Protein, P-gp), la protéine de résistance aux drogues multiples (Multidrug Resistant Protein 1, MRP1 ), et la protéine mammaire de résistance cancéreuse (Breast Cancer Resistant Protein, BCRP). Cestransporteursfonctionnentcommedes ''pompes à efflux'' transportantles xénobiotiques à l'extérieur de la cellule. La P-gp est aussi responsable du faible transport d'un grand nombre de composés de la lumière intestinale à la circulation sanguine. Conséquemment, la modulation de leurs activités peut être essentielle pour le succès des thérapies de plusieurs maladies, plus spécifiquement celles impliquant une chimiothérapie. Plusieurs modulateurs des systèmes d'efflux ont déjà été testés. Un type de modulateur sont les copolymères amphiphiliques en bloc (poloxamers) de la famille des Pluronics® et qui représenteront un intérêt particulier dans notre étude pour leur composition potentielle dans la formulation de drogues. Les Pluronics® sont composés de poly(éthylène oxide)(PEO) et de poly(propylène oxide) (PPO), ayant une structure (PEO)x(PPO)y(PEO)x (Schmolka, 1977). Des études in vitro et in vivo précédentes ont démontré 1'habileté des Pluronics® à sensibiliser des cellules cancéreuses MDR surexprimant la P-gp (Alakhov et al., 1996; Yenne et al., 1996; Batrakova et al., 1996; Batrakova et al. 2003). Dans d'autres études utilisant des cellules transfectées avec MRP1 et MRP2 (cellules Madin Darby Canine Kidney (MDCKII), et des cellules cancéreuses de poumon résistantes à la doxorubicine et surexprimant MRP1 (cellules COR-L23R), il a été démontré que le Pluronic® P85 augmente l'accumulation de vinblastine et de doxorubicine. Cependant, le Pluronic® P85 n'a montré aucun effet d'augmentation de cytotoxicité de la doxorubicine dans les cellules résistantes COR-L23/R (Batrakova et al., 2003).udL'objectif général de notre étude est d'examiner in vitro l'effet des Pluronics® sur la fonction transporteur de trois protéines du type ABC impliquée dans la résistance aux drogues multiples: P-gp, BCRP et MRPl. Plus spécifiquement, au départ 21 copolymères ont été testés pour la détermination de la concentration critique de micellisation (CMC),une des propriétés de base des surfactants. Également, le niveau de leur activité à induire l'accumulation du substrat rhodamine 123 (R123) dans les cellules cancéreuses mammaires (MCF-7 ADR) surexprimant la P-gp a été caractérisé. Ensuite les Pluronics® L61 et P85 ont été sélectionnés pour d'autres études afin de tester leur niveau inhibiteur à moduler l'activité des transporteurs membranaire P-gp, MRP1 et, pour la première fois, la BCRP. Pour chaque transporteur, les études absorption et de cytotoxicité ont été effectuées sur les cellules cancéreuses mammaires résistantes à la doxorubicine (MCF-7 ADR) surexprimant la P-gp, et les cellules leucémiques résistantes à la doxorubicine (HL-60udADR) surexprimant la MRPI. Les cellules cancéreuses mammaires résistantes au topotecan (MCF-7 TPT) surexprimant la BCRP ont été sélectionnées progressivement à partir des cellules MCF-7 parental exposées au topotecan hydrochloride (TPT). Les études d'accumulation ont examiné l'influence des Pluronics® et d'autres inhibiteurs d'efflux (cyclosporine A, vérapamil, 1 7 B-estradiol, GF120918) sur 1'accumulation intracellulaire de différentes sondes comme substrat (rhodamine 123, fluorescéine, doxorubicine, mitoxantrone, topotecan). De plus, l'activité inhibitrice des Pluronics® a été comparée aux autres modulateurs d'efflux mentionnés ci-haut. Également, les tests de cytotoxicité ont déterminé la sensibilisation des cellules résistantes aux drogues cytotoxiques en présence du Pluronic® L61. Pour cela, les cellules ont été exposées à un traitement de drogues­ polymères et la viabilité des cellules a été examinée à l'aide d'un test standard de XTT.udLes études d'accumulation ont démontré que les cellules MCF-7 ADR surexprimant la P-gp ont répondu le plus aux effets inhibiteurs des Pluronics®. Les polymères hydrophobiques comme les Pluronics® L92, L61 et P123 à leur concentration maximale d'efficacité ont augmenté l'accumulation de R123 dans les cellules MCF-7udADR, davantage que Pluronic® P85, le polymère moins hydrophobe. Les Pluronics® ont démontré une efficacité limitée pour l'inhibition de l'efflux médié par la BCRP et le MRPI. Les Pluronics® L61 et P85 ont été inefficaces à augmenter l'accumulation de TPT dans les cellules MCF-7 TPT surexprimant la BCRP. Cependant les deux polymères ont augmenté l'accumulation de R123 dans les cellules surexprimant la BCRP et la MRPI. Finalement, une augmentation similaire d'accumulation de R123 a été occasionnellement observée dans les cellules MCF-7 parentales, MRP1 et BCRP négative. Cet effet noté ne semble pas être lié à la co-expression de la P-gp, puisqu'un manque d'activité des inhibiteurs connus de la P-gp a été observé: vérapamil et cyclosporine A sur les cellules HL ADR, et GF120918 sur les cellules MCF-7 TPT. Également dans nos etudes, l'effet observé des polymères sur les cellules HL ADR ne peut pas être clairement attribué à la surexpression de la MRPl. Une observation importante a été faite au cours de l'étude portant sur la sélectivité du substrat pour les systèmes d'efflux P-gp, MRPI et BCRP inhibés par les Pluronics® et par d'autres inhibiteurs. Les Pluronics® L61 et P85 ont eu un effet inhibiteur en augmentant l'accumulation de tous les substrats testés: Rl23, doxorubicine, MTX et TPT. Cependant, ces mêmes polymères ont seulement démontré l'effet sur l'accumulation de la Rl23 dans les cellules surexprimant MRPI et BCRP. Les études de cytotoxicité ont démontré que 1'effet de sensibilisation du Pluronic® L61 a été plus important pour les cellules MCF-7 ADR surexprimant la P-gp que pour les cellules HL 60 ADR exprimant la MRPl. Aucune sensibilisation n'a été observée sur les cellules MCF-7 TPT surexprimant la BCRP.udEn conclusion, les Pluronics® sont très efficaces à inhiber l'efflux médié par la P­ gp, moins efficace pour la MRP1 et démontre une efficacité limitée pour la BCRP. Évidement nos travaux représentent des études préliminaires portant sur 1'effet des Pluronics® sur la résistance médiée par la BCRP. Dans le future, nous devrons prévoir des recherches plus détaillées en étendant le criblage des Pluronics® sur les cellules de type variées surexprimant la BCRP ou la MRPI. Nous devrons aussi inclurè des investigations additionnelles portant sur l'influence des Pluronics® au niveau de la concentration intracellulaire d'ATP et au niveau de la viscosité membranaire cellulaire. De plus, pour des études plus détaillées sur les effets des Pluronics® et pour caractériser la contribution des transporteurs sur l'accumulation des substrats, des études à base d'expression et inhibition (expression par vecteur, siRNA) peuvent être envisagées. Ensuite ces études pourrontudétendre sur d'autres transporteurs.