HL-60细胞核干细胞因子下调对p38MAPK通路相关蛋白的影响

摘要

目的：
　　通过回顾本课题组前期研究结果，发现下调p53缺失型白血病HL-60细胞核干细胞因子（Nucleostemin，NS）后，该细胞p38MAPK基因发生明显上调，本研究主要对p38MAPK通路中的相关蛋白的表达改变进行检测，分析NS与p38MAPK通路之间的相关性，初步探索NS下调后所导致该通路变化的可能原因，为进一步探索NS非依赖性p53信号通路的具体机制提供理论依据。
　　方法：
　　（1）本课题组前期已经构建好针对NS基因的重组慢病毒载体（NS-RNAi-GV248）和阴性空载体，直接从公司病毒库购买。
　　（2）根据HL-60细胞的合适的MOI值及病毒滴度，将NS-RNAi-GV248慢病毒载体转染至人白血病细胞株HL-60细胞内以下调其NS的表达，通过倒置荧光显微镜观察转染的效率，采用WesternBlot技术测定HL-60细胞内NS蛋白的下调情况。
　　（3）采用WesternBlot技术检测慢病毒感染后空白对照组、阴性对照组及实验组HL-60细胞中p38MAPK通路中的相关蛋白的表达情况，即p-p38MAPK/p38MAPK两个比值的变化。
　　（4）采用ImageJ图像处理软件对目的蛋白条带的灰度进行比对分析并计算。采用SPSS17.0统计软件对数据结果进行处理分析，所有的数据以均数±标准差(x±s)表示，多组独立的样本之间的比较采用单因素方差分析，而进一步两两样本之间的比较则采用Bonferroni法，校正检验水平α’=0.0167，P<0.05表示数据之间的差异有统计学意义。
　　结果：
　　（1）根据本课题组前期研究结果，NS-RNAi-GV248慢病毒载体感染人白血病细胞株HL-60细胞的最适MOI值为80。以MOI=80的条件感染HL-60细胞，倒置荧光显微镜观察显示慢病毒载体转染效率达到80％以上；WesternBlot检测结果显示：慢病毒转染后实验组中HL-60细胞的NS蛋白表达量出现了明显的下调。
　　（2）WesternBlot技术的检测结果显示慢病毒转染后实验组中HL-60细胞p-p38/p38的比值（0.444±0.008）高于阴性对照组（0.286±0.016）和空白对照组（0.261±0.019）（P<0.05），表示NS表达下调后p38MAPK通路中的p-p38MAPK蛋白表达量增加。
　　结论：
　　（1）HL-60细胞内p38MAPK通路中的p-p38蛋白的表达与NS表达下调呈负相关。
　　（2）NS非依赖性p53的作用过程可能与激活p38MAPK通路有关，p38MAPK通路可能是NS的p53非依赖性通路之一。

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引言

1 实验材料

1.1 细胞系及菌株

1.2 主要试剂和材料

1.3 主要仪器

1.4 主要试剂配制

1.5 主要分析软件

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 实验分组

2.3 重组慢病毒载体NS-RNAi-GV248转染HL-60细胞

2.4 Western Blot 检测重组慢病组载体对HL-60细胞的转染效率及p38MAPK通路中关键蛋白的变化

3 结果判断

3.1 蛋白浓度的测定

3.2 Western Blot结果的判断

3.3 统计学分析

4 结果

4.1 倒置荧光显微镜下观察转染96h时HL-60细胞的情况

4.2 Western Blot检测NS在蛋白水平的抑制效果

4.3 Western Blot检测慢病毒载体转染HL-60细胞96h后细胞内p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达情况

5 讨论

5.1 NS的非p53依赖通路

5.2 p38MAPK通路与肿瘤细胞凋亡

5.3 NS与p38MAPK通路的关联性

6 结论

参考文献

综述: 核干细胞因子研究进展

个人简历

致谢