右美托咪定通过抑制JNK通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

摘要

背景及目的：
　　缺血性脑血管病致死率、致残率高，严重威胁人类健康，而且缺血区重新恢复血液灌注后，常发生缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤涉及一系列的复杂的病理生理学过程，包括氨基酸兴奋性毒性、自由基损伤、Ca2+超载、炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能障碍等，而细胞凋亡在其中起着重要的作用。作为MAPK家族的三大成员之一，JNK能够被一系列细胞外刺激激活，通过线粒体途径和死亡受体途径诱导caspase级联反应激活caspase-3，促进细胞凋亡，加快缺血区脑细胞的死亡速度。
　　右美托咪定是高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，其受体在中枢神经系统、外周神经系统和自主神经节中广泛分布，大量基础研究表明右美托咪定有抗炎抗凋亡的特性，但机制并未完全清楚。
　　本研究试图建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，通过给予右美托咪定（Dex）、α2肾上腺素受体拮抗剂育亨宾（Yoh）、JNK通路抑制剂SP600125，探讨右美托咪定在脑缺血再灌注损伤中的作用是否与JNK有关，为临床更好的恢复脑缺血后大脑功能提供更为确切的理论依据。
　　材料与方法：
　　SD大鼠随机分为八组（n=24），Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组、I/R组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组。I/R组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组采用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型（MCAO），Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组仅分离血管，不进行血管结扎及线栓置入，其余手术操作同缺血组。Sham+Yoh+Dex组和I/R+Yoh+Dex组在分离血管或缺血前30min腹腔注射0.5mg/kg育亨宾，分离血管或缺血即刻尾静脉泵注右美托咪定3ug/kg，5min内泵完，后6ug·kg-1·h-1持续泵注2h。Sham+Dex组和I/R+Dex组在分离血管或缺血前30min给予等量生理盐水，分离血管或缺血即刻给予右美托咪定。Sham组和I/R组则均给予等量生理盐水。Sham+SP600125组和I/R+SP600125组则是分离血管或造模前30min侧脑室注射10ulSP600125（溶于1％DMSO中，浓度30mg/ml）。建立大鼠暂时性局灶性脑缺血再灌注模型，缺血90min后拔出线栓，再灌注24h后进行神经功能评分；随后处死大鼠，采用干湿比法检测脑组织含水量，TTC染色测定脑组织梗死面积，免疫荧光观察脑组织p-JNK、活化的caspase-3表达变化，Western-blot分析JNK、p-JNK蛋白含量，阐明右美托咪定在大鼠脑缺血再灌注损伤中产生保护作用的可能机制。
　　统计学分析：
　　收集数据并采用SPSS17.0统计分析软件进行处理。定量资料采用均数±标准差（(-X)±S）表示，多组间定量资料比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用最小显著差异（leastsignificantdifference,LSD）t检验，检验水准取α=0.05。
　　结果：
　　1、神经功能评分的比较
　　Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组大鼠从清醒至取脑组织前均无神经功能缺损症状，无统计学差异（P>0.05）；与Sham组比较，I/R组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组大鼠均有不同程度的左前肢肢体偏瘫症状，神经功能评分均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组相比，I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组神经功能评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；I/R+Yoh+Dex组神经评分较I/R+Dex组明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2、脑组织含水量变化
　　Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组之间无统计学差异（P>0.05）；与Sham组相比，I/R组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组脑组织含水量均明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组相比，I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组脑组织含水量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；I/R+Yoh+Dex组与I/R+Dex组相比，脑组织含水量明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　3、脑梗死面积的比较
　　Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组未发现梗死灶，无统计学差异（P>0.05）；与Sham组相比，I/R组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组脑组织梗死面积明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组相比，I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组脑组织梗死面积明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；I/R+Yoh+Dex组与I/R+Dex组相比，脑组织梗死面积增加，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　4、免疫荧光观察JNK和caspase-3激活
　　1.p-JNK的表达Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组可见少量p-JNK阳性细胞，差异无统计学意义（P>0.05）；与Sham组相比，I/R组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组大鼠脑组织出现大量p-JNK阳性细胞，p-JNK表达显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组相比，I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组p-JNK表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R+Dex组相比，I/R+Yoh+Dex组p-JNK表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光双标显示，p-JNK与GFAP标记的星形胶质细胞存在共表达现象。
　　2.cleavedcaspase-3的表达Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组可见少量cleavedcaspase-3阳性细胞，差异无统计学意义（P>0.05）；与Sham组相比，I/R组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组大鼠脑组织出现大量cleavedcaspase-3阳性细胞，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组相比，I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组cleavedcaspase-3的表达下调，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R+Dex组相比，I/R+Yoh+Dex组cleavedcaspase-3阳性细胞增多，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　5、免疫印迹检测脑组织JNK及p-JNK蛋白含量
　　Sham组、Sham+Dex组、Sham+Yoh+Dex组、Sham+SP600125组p-JNK蛋白含量无统计学差异（P>0.05）；与Sham组相比，IR组、I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组p-JNK蛋白含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R组相比，I/R+Dex组、I/R+Yoh+Dex组、I/R+SP600125组p-JNK蛋白含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与I/R+Dex组相比，I/R+Yoh+Dex组p-JNK蛋白含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1．JNK信号通路参与了脑缺血再灌注损伤，阻断JNK可减少凋亡执行者caspase-3的激活，进而减轻缺血再灌注损伤。
　　2．右美托咪定能减轻脑缺血再灌注损伤，可能的机制为激动α2肾上腺素能受体，抑制JNK的磷酸化，减少caspase-3的激活。

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中文摘要

英文摘要

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缩略词表

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 标本采集及检测方法

4 统计学分析

结果

1 神经功能评分

2 脑组织含水量变化

3 脑梗死面积变化

4 免疫荧光观察JNK和caspase-3的激活

5 免疫印记检测JNK和p-JNK的表达

讨论

1 脑缺血再灌注损伤模型的选择及制备

2 JNK与缺血再灌注损伤

3 右美托咪定在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制

4 研究不足之处

结论

参考文献

综述:右美托咪定神经保护作用的机制及临床应用

个人简历及在校期间发表论文

致谢