志贺菌、大肠杆菌中CRISPR/Cas系统分布及其与毒力和耐药的关系

摘要

志贺菌是感染性腹泻的病原体之一，可引起细菌性痢疾；致病性大肠杆菌可引起肠内和肠外感染；强毒株和（或）多耐药株的出现严重危害人类的健康。近年来由于抗生素的广泛使用，环境中的敏感菌在抗生素长期低浓度诱导下，可成为耐药菌或多耐药菌（MDR）。环境与临床分离大肠杆菌耐药性和耐药基因方面的差异已有报道，但是对于二者CRISPR位点分布的研究尚未发现。
　　目的:
　　1.通过描述志贺菌、临床和环境分离大肠杆菌中CRISPR/Cas系统、耐药表型、耐药基因、毒力表型和毒力基因的分布，探讨CRISPR/Cas系统与耐药和毒力之间的关系。
　　2.分析志贺菌中插入序列IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 mRNA表达水平的影响及其与耐药和毒力的关系。
　　方法:
　　1. PCR扩增 CRISPR位点并测序，通过 CRISPR Finder软件分析测序结果，CRISPR Target软件分析间隔序列。
　　2.改良Kirby-Bauer（K-B）纸片法进行药敏试验，PCR扩增耐药基因。
　　3.台盼蓝细胞计数实验检测细菌毒性，PCR扩增毒力基因。
　　4.采用Real-time PCR（RT-PCR）方法检测CRISPR相关蛋白基因cse2 mRNA表达水平。
　　5.采用选择培养基方法分离水体中肠杆菌，通过16srRNA方法联合美国梅里埃API生化试纸条鉴定细菌。
　　结果:
　　1. CRISPR位点检测结果：33株志贺菌、40株临床分离大肠杆菌、32株环境分离大肠杆菌均能检出CRISPR1、2、3位点，经CRISPR Finder软件分析均为CRISPR位点，共检出1469条间隔序列，包含376条特异性的间隔序列。通过CRISPR Target软件寻找同源质粒或噬菌体所对应的编码产物，匹配上的间隔序列有60条。临床分离大肠杆菌CRISPR3位点检出率高于环境分离株，且差异有统计学意义。
　　2. CRISPR位点与耐药表型、耐药基因的关系：33株志贺菌对AMP、TCY、SXT、NOR、CL等抗生素耐药率依次为42.42％、72.73%、81.82%、12.12%、30.30%；cat、sul2、blaCTX等耐药基因阳性率依次为54.55%、66.67%、57.58%。环境分离大肠杆菌中，CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3与阿莫西林棒酸分布差异均有统计学意义。临床分离大肠杆菌中，CRISPR1、CRISPR2与复方新诺明分布差异均有统计学意义。
　　3. CRISPR位点与毒力表型、毒力基因的关系：33株志贺菌中毒力基因ipaH、ial、ipaBCD、virA、icsA、icsP的检出率依次为100.00%、100.00%、75.76%、84.85%、87.88%、84.85%；志贺菌侵染Hela细胞后死亡率范围为3.0%-42.5%。CRISPR1位点阳性志贺菌致Hela细胞死亡率较阴性菌低，差异有统计学意义。大肠杆菌 CRISPR2与毒力基因 ial分布差异有统计学意义。
　　4.插入序列IS600对cse2 mRNA表达水平的影响：33株志贺菌中cse2阳性率为93.94%（31/33），其中无IS600的细菌有12株，有IS600的有19株，有IS600细菌cse2表达水平低于无IS600菌，且差异有统计学意义。
　　5.细菌的分离与鉴定：水中共分离86株细菌，包括肠杆菌科74株，气单胞菌5株，芽孢杆菌3株，假单胞菌2株，胡萝卜软腐果胶杆菌1株，噬线虫共生菌1株。
　　6.环境与临床分离大肠杆菌耐药表型比较：临床分离大肠杆菌的AMP、CTX、FEP、CN、CIP、LEV、TE、SXT等抗生素的耐药率均高于环境分离株，差异均有统计学意义；环境分离大肠杆菌的AK耐药率高于临床分离株，差异有统计学意义。
　　结论:
　　1.志贺菌和大肠杆菌中CRISPR位点分布广泛，检出率高。
　　2.志贺菌中CRISPR1位点阴性菌毒力强；未发现CRISPR位点与耐药分布有关。
　　3.志贺菌中插入序列IS600使cse2 mRNA表达水平降低。
　　4.环境分离大肠杆菌较临床分离株耐药率低。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略词表

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果

3.1 志贺菌的复苏、分离培养、鉴定

3.2 PCR扩增CRISPR位点及CRISPR相关蛋白基因cse2

3.3 志贺菌中CRISPR/Cas系统与耐药的关系

3.4 志贺菌CRISPR/Cas系统与毒力的关系

3.5 Real-time PCR检测CRISPR相关蛋白基因cse2 mRNA相对表达水平

3.6 大肠杆菌CRISPR/Cas系统的检测及其与毒力、耐药的关系

4 讨论

4.1 志贺菌和大肠杆菌中CRISPR位点分布

4.2 CRISPR/Cas系统与耐药的关系

4.3 CRISPR/Cas系统与毒力的关系

4.4 插入序列IS600对志贺菌CRISPR相关蛋白基因cse2 mRNA表达的影响

4.5 环境与临床分离大肠杆菌的差异

4.6 创新性与局限性

5. 结论

参考文献

综述: 致病微生物CRISPR/Cas系统的研究现状

个人简历

致谢