志贺菌中CRISPR/Cas系统的检测及其与毒力基因的关系

摘要

志贺菌可导致菌痢，其致病性主要在于毒力因子的编码产物对粘膜上皮的毒性和侵袭作用，部分毒力基因存在于噬菌体和质粒等可移动的遗传元件上，可通过HGT方式在细菌中传播导致更多高毒菌株的出现。CRISPR/Cas系统是近年来发现的细菌处理质粒以及噬菌体等外源物质的原核生物的免疫系统。因为此系统对于细菌遗传物质的整合和获得具有重要作用，导致 CRISPR/Cas系统受到越来越多的关注。目前关于志贺菌 CRISPR/Cas系统的研究较少，且关于志贺菌中该系统与毒力基因的关系的研究尚未见报道。　　目的:　　探索志贺菌中 CRISPR/Cas系统的分布及特征，初步探讨该系统与毒力基因的关系。　　方法:　　1.根据 GenBank中宋内志贺菌53G和 Ss046以及福氏志贺菌2457T的CRISPR及cas基因的序列信息，利用Primer designingtool在线软件设计引物。　　2.对实验室保存的59株志贺菌中CRISPR及cas2-cas1、cas6e-cas5、cas7、cse2、cse1-cas3基因进行PCR扩增和测序，并通过生物信息学软件对序列进行分析。　　3.PCR扩增志贺菌毒力基因ipaH、ial、ipaBCD、icsA、icsP以及virA基因，并分析CRISPR与毒力基因的关系。　　结果:　　1.针对志贺菌中 CRISPR/Cas系统所设计引物均特异性扩增出相应条带，并可扩增出cas基因中的插入序列。　　2.在59株志贺菌中共发现3个 CRISPR：CRISPR1/Cas系统的检出率为79.7％（47/59），其中约2/3的菌株该系统中发现插入序列；CRISPR2的检出率为84.7%；CRISPR3的检出率为83.1%（49/59）。　　3. CRISPR中重复序列保守性较低，出现退化现象；共发现33条特异间隔序列，间隔序列在不同菌株之间分布较一致，不能作为志贺菌分型标志；CRISPR3中的间隔序列可以匹配I-F cas基因且该位点附近未发现I-F cas基因。　　4. cas基因序列与CRISPR1中间隔序列数目有关；cas2、cas1、cas5和cas3基因的序列一致性在94%以上；cas6e、cas7、cse2及 cse1基因序列一致性在81%-99%之间，并在cse2基因中发现IS600，cas6e基因中发现ISSfl2，cse1基因中发现IS629。　　5.志贺菌ipaH、ial、ipaBCD、icsA、icsP和virA基因的检出率依次为100%、100%、86.4%、100%、98.3%和98.3%；其毒力基因的优势组合类型为ipaH+ial+ipaBCD+icsA+icsP+virA，所占百分比为84.7%。　　6. CRISPR1和CRISPR2与毒力基因ipaBCD的分布之间无关（P>0.05）；CRISPR1和CRISPR2中间隔序列数目与毒力基因ipaBCD之间差异无统计学意义（P>0.05）；CRISPR1/Cas系统中是否含有插入序列与毒力基因ipaBCD的分布之间差异没有统计学意义（P>0.05）。　　结论:　　1. CRISPR在志贺菌中广泛分布， CRISPR3可能为功能性的抗CRISPR I-F型系统（anti-CRISPRI-F system）。　　2. cas基因序列的不同会影响间隔序列的数目；部分志贺菌cas基因中发现插入序列。　　3.志贺菌CRISPR中重复序列出现退化；间隔序列在不同菌株间变化较小，使得CRISPR不能成为分型标志物。　　4.志贺菌毒力基因携带率较高，未发现CRISPR与毒力基因分布有关。

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英文缩略词

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 志贺菌CRISPR的PCR扩增结果

3.2 志贺菌CRISPR相关蛋白基因的PCR扩增结果

3.3 志贺菌CRISPR的测序结果分析

3.4 志贺菌CRISPR的结构分析

3.5 志贺菌cas基因的测序结果分析

3.6 志贺菌中CRISPR1/Cas系统在志贺菌中的分布

3.7 志贺菌中毒力相关基因的检测和分析

3.8 志贺菌中CRISPR与毒力相关基因的关联分析

4 讨论

4.1 志贺菌中CRISPR的分布

4.2 志贺菌CRISPR中重复序列的分析

4.3 志贺菌中间隔序列的分布

4.5 志贺菌CRISPR中间隔序列的同源性比对

4.5 志贺菌CRISPR相关基因的分布和特征

4.6 志贺菌毒力相关基因的分布

4.7 志贺菌CRISPR与毒力基因关系的探讨

4.4 优点与局限性

5 结论

参考文献

综述:CRISPR/Cas系统与细菌毒力关系的研究进展

个人简历和硕士期间发表的论文

致谢

附录