匹罗卡品致痫小鼠海马神经元线粒体移动变化研究

摘要

目前全世界约有5000万人患有癫痫，它是临床上最常见的神经系统疾病之一。由于长期反复发作，并且严重降低患者的生活质量，因此探索癫痫的发病机制和积极寻找新的治疗靶点具有重要意义。线粒体的功能在癫痫的影响下会发生紊乱，线粒体损伤促使呼吸链中活性氧增多，线粒体的DNA发生突变，巯基发生氧化，蛋白质交联。DNA的甲基化功能下降，最后引起一系列的病理改变，如组蛋白乙酰化出现异常以及生物膜脂质被过度氧化，最终导致细胞内堆积大量变性蛋白和受损细胞器。膜电位在线粒体受到损伤时下降明显，伴随着线粒体通透性转运增加，细胞色素C(Cyt c)和凋亡诱导因子(AIF)被释放到细胞质中诱导细胞凋亡，细胞凋亡促使神经元对于癫痫损伤更加敏感，这形成恶性循环。所以，对受损的线粒体进行及时的清除非常关键。
　　线粒体移动在维持线粒体功能稳定和清除受损线粒体方面发挥了非常重要的作用。线粒体移动可将受损线粒体逆行转运至胞体被降解和回收，同时将正常线粒体顺向运动至神经元的作用部位而发挥功能。线粒体功能正常情况下，线粒体通过移动来使得其分布正常，而且不仅如此，其还能够将线粒体移动到合适的位置来应对其损伤。
　　目前为止，针对线粒体移动的具体机制还不是完全清楚。Miro属于小GTPase家族成员，与线粒体的移动密切相关。研究表明，Miro与Milton可在神经细胞中形成复合物并与肌球蛋白重链(KHC)相连接，以此来控制微管内线粒体的移动。线粒体的转运在miro1突变时会受到抑制，使线粒体聚集形成为丝状线粒体。此外，还有研究显示，在H9c2细胞及原代脑皮层神经细胞中，Miro表达量的多少影响线粒体移动的活力。目前在癫痫发作后神经元线粒体损伤中线粒体移动异常发挥何种作用还不清楚，然而，其能否通过控制线粒体的移动来影响神经对其的保护作用，这点还有待研究。
　　目的:
　　本课题通过观察匹罗卡品致痫小鼠海马线粒体移动相关蛋白Miro1表达水平变化，探讨线粒体移动在癫痫神经元损伤中的作用，同时构建腺病毒真核表达质粒提高Miro1表达，观察致痫小鼠行为学、神经细胞凋亡，海马神经元缺失的变化情况，以及检测氧化应激相关生理及分子指标MDA，Mn-SOD，GSH-Px和ND6变化情况，并通过检测凋亡相关物质Bax，Bcl-2，Bcl-xL，细胞色素c，caspase-3和caspase-9等表达水平变化，探讨癫痫发作后神经元损伤的神经保护机制。
　　方法:
　　48只成年健康雄性的C57BL/6小鼠，体重在18-25g，随机分成四组:正常组（正常小鼠）、致痫组（癫痫小鼠）、对照腺病毒组（癫痫小鼠注射对照空载腺病毒）及Miro1过表达腺病毒组（癫痫小鼠注射Mrio1过表达重组腺病毒）。后两组小鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉（0.004ml/g），用脑立体定位仪取平颅位固定小鼠。剃去小鼠颅顶毛发，用75％的酒精消毒颅顶皮肤后，皮肤开口约1cm。再用碘伏消毒，显出颅骨骨缝。定位AP=-0.3mm; ML=-1.0mm; DV=-2.0mm，注射2μl Miro1过表达重组腺病毒或者对照腺病毒载体，20min内缓慢注射完毕，注射后留针10min，将针尖移出，消毒后用骨蜡填塞骨孔，缝合皮肤。上述24h后后三组小鼠皮下注射1mg/kg的东莨菪碱，30min后腹腔注射匹罗卡品(340mg/kg)诱导癫痫持续状态。小鼠癫痫持续状态持续发作90min时，腹腔注射地西泮(6mg/kg)终止癫痫发作。小鼠癫痫模型制作成功标准依据Racine痫性发作分级标准进行判定，造模成功后分别记录小鼠的致痫成功率及潜伏期。小鼠在癫痫持续状态发作24h时，被麻醉断头取脑，并迅速分离出双侧海马，临死前进行脑电图描记。Real-Time PCR法检测Miro1 mRNA表达水平。检测氧化应激相关生理指标MDA，Mn-SOD及GSH-Px，并使用Western blot检测小鼠海马Miro1、ND6、Bax、Bcl-2、Bcl-xL、细胞色素c、caspase-3和caspase-9等表达水平。剩余小鼠在癫痫持续状态后72h时麻醉后灌注取脑，采用尼氏染色法检测癫痫小鼠海马神经元损伤，并且采用TUNEL法检测小鼠海马神经元凋亡情况。
　　以均数±标准差((x)±s)来表示所有研究数据资料，统计学分析应用SPSS20.0软件进行。致痫成功率采用卡方检验(Chi-Square Tests)比较，其余采用单因素方差分析方法(ANOVA)进行组间比较，两组间比较采用LSD(Least-SignificantDifference)-t检验，显著性水平为α=0.05。
　　结果:
　　1.致痫小鼠行为学观察及脑电图结果
　　正常组小鼠行为及脑电图均正常。按照Racine痫性发作分级，在腹腔注射匹罗卡品后，癫痫组、对照腺病毒组及Miro1过表达腺病毒组三组小鼠痫性发作级别可达到Ⅳ-Ⅴ级并出现癫痫持续状态，癫痫模型造模成功率以及痫性发作潜伏期在上述三组小鼠之间均无显著性差异(p＞0.05);三组小鼠在腹腔注射匹罗卡品后脑电图可以描记到多量的高幅的棘波、尖波及其棘（尖）慢综合波。
　　2.病理学观察
　　2.1 Nissl染色结果:
　　SE发作后72h时与正常组相比，癫痫组、对照腺病毒组及Miro1过表达腺病毒组三组小鼠海马CA3区神经元有明显缺失，神经元计数明显减少，统计有显著性差异(p＜0.05);SE后72h时与对照腺病毒组相比，Miro1过表达腺病毒组小鼠海马CA3区神经元计数明显增多，统计有显著性差异(p＜0.05)。
　　2.2 TUNEL法结果:
　　SE发作后72h时与正常组相比，癫痫组、对照腺病毒组及Miro1过表达腺病毒组三组小鼠海马CA3区神经元凋亡明显增多，有显著性差异(p＜0.05)。SE后72h时与对照腺病毒组相比，Miro1过表达腺病毒组小鼠海马CA3区神经元凋亡数目减少，有显著性差异(p＜0.05)。
　　3.线粒体移动相关蛋白Miro1表达检测:
　　3.1 mRNA水平
　　相比于正常组，癫痫能够显著抑制小鼠海马组织中Miro1 mRNA水平的表达(p＜0.05)，注射Miro1过表达重组腺病毒能够有效上调小鼠海马组织中Miro1的mRNA表达水平(p＜0.05)。
　　3.2 蛋白水平
　　相比于正常组，癫痫能够显著抑制小鼠海马组织中Miro1蛋白水平的表达(p＜0.05)，注射Miro1过表达重组腺病毒能够有效上调小鼠海马组织中Miro1的蛋白表达水平(p＜0.05)。
　　4.氧化应激相关生理及分子指标检测
　　相比于正常组，癫痫能够显著抑制小鼠海马组织中Mn-SOD及GSH-Px的活性，上调MDA的水平，而注射Miro1过表达重组腺病毒能够有效抑制癫痫诱导的MDA积累，同时上调海马组织中Mn-SOD及GSH-Px的活性(p＜0.05)。相比于正常组，癫痫能够显著抑制小鼠海马组织中ND6的表达，而注射Miro1过表达重组腺病毒能够有效提高海马组织中ND6的水平(p＜0.05)。
　　5.凋亡相关蛋白表达检测
　　数据结果显示，相比于正常组，癫痫能够显著抑制小鼠海马组织中抗凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表达水平，诱导促凋亡蛋白Bax以及caspase-3、caspase-9的表达活化，胞浆中CytC含量升高，线粒体中CytC含量下降。Miro1过表达重组腺病毒注射能够逆转癫痫诱导的小鼠海马组织中上述指标的变化。
　　结论:
　　1.癫痫模型小鼠海马组织中Miro1 mRNA以及蛋白的表达水平均低于正常小鼠，这说明线粒体移动的变化是参与了癫痫病理损伤过程的。Miro1过表达重组腺病毒注射能够一定程度上恢复海马组织中Miro1的表达。
　　2.癫痫能够诱导小鼠海马组织线粒体损伤以及氧化应激的发生，Miro1过表达重组腺病毒注射能够降低癫痫模型小鼠海马组织中线粒体损伤以及氧化应激程度。
　　3.癫痫能够诱导小鼠海马组织线粒体途径细胞凋亡的发生，Miro1过表达重组腺病毒注射能够抑制癫痫模型小鼠海马组织中的细胞凋亡。
　　4.提高线粒体移动相关蛋白Miro1表达，可以通过降低致痫小鼠海马组织中线粒体损伤以及氧化应激程度并抑制海马神经元凋亡而发挥神经保护作用，这有可能成为癫痫发作后神经损伤新的神经保护治疗靶点。提高线粒体移动有可能成为癫痫发作后神经损伤新的神经保护治疗策略。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 匹罗卡品致痫小鼠海马神经元的线粒体移动研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

第二部分：侧脑室内注射Miro1过表达重组腺病毒载体对匹罗卡品诱导的癫痫小鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述

个人简历、在学期间发表的学术论文与科研成果

致谢