Clec9a亲和肽的筛选及其靶向DC的免疫活性研究

摘要

目的:
　　树突状细胞（dendritic cell，DC）是一类最重要的参与T淋巴细胞应答的抗原递呈细胞，介导自身免疫耐受和调节适应性免疫应答。基于DC的肿瘤疫苗能够有效激活抗肿瘤的CD8+T细胞反应，是一种越来越有效的免疫治疗工具。研究发现的Clec9a分子特异性表达在小鼠的CD8α+DC和CD103+DC以及与其功能相当的人的BDCA3+DC上。这些类群的DC被认为具有很强的交叉递呈能力和刺激初始T细胞（na(i)ve T）增殖能力。因此CD8α+DC-亲和肽有助于抗原靶向、刺激na(i)ve T细胞增殖和引发CTL反应，而Clec9a对于CD8α+DC交叉递呈起着关键的作用。Clec9a是选择性表达的内吞性受体，所以抗原靶向到Clec9a分子具有提高DC交叉递呈外源性或内源性抗原的能力，同时能增强T细胞抗肿瘤免疫应答。Clec9a通过其C型凝集素结构域(CTLD)与配体分子细胞骨架蛋白F-actin相互作用，引起免疫反应。因此我们以mClec9a-CTLD为靶点，利用噬菌体展示肽库技术筛选到靶向mClec9a的亲和肽。利用FL-DC或过表达mClec9a细胞(HEK-293TmClec9a)以及计算机对接模型对靶向肽的亲和性和结合特征进行了研究。通过经典的DC/OVA257-264/OT-1模型，验证靶向肽的交叉递呈作用和刺激na(i)veT细胞增殖能力。体内免疫实验和抗肿瘤实验验证了抗原靶向后具有诱导CTL引发和增强抗肿瘤免疫应答的能力，为肿瘤疫苗的靶向治疗提供了理论基础。
　　方法:
　　(1)真核蛋白mClec9a-CTLD的表达、鉴定和纯化:磷酸钙转染法表达;Western blotting鉴定;Vivaflow200超滤浓缩上清、anti-FLAG M2 beads亲和层析和superdex G200分子筛纯化，获得高纯度的蛋白。(2)亲和噬菌体的筛选、鉴定:标准固相噬菌体展示肽库筛选技术;噬菌体克隆的DNA序列测定以及氨基酸序列分析;噬菌体ELISA鉴定噬菌体克隆与mClec9a-CTLD的亲和性。(3)亲和肽的合成和鉴定:标准Fmoc固相合成法;反向高效液相色谱纯化与质谱鉴定。(4)肽亲和性的验证:体外诱导FL-DC和GM-DC;流式细胞术检测mClec9a的表达和肽的亲和性。(5)亲和位点的确定:计算机模拟WH肽与mClec9a相互作用模式;QuichChange方法构建pIRES2-mClec9a单氨基酸突变载体;(6)体外交叉递呈实验:利用DC/OVA257-264/OT-1模型，验证抗原靶向FL-DC的交叉递呈能力和刺激na(i)ve T细胞增殖的能力，即利用CFSE来检测刺激na(i)ve T细胞增殖的能力，ELISA检测T细胞分泌IFN-γ的量，利用qRT-PCR检测T细胞杀伤性分子perforin和Grz BmRNA的相对表达量。(7)体外CTL引发实验:通过3轮多肽和CpG ODN1826皮下免疫C57BL/6J小鼠，每7天一次，最后获取脾细胞，利用OVA257-264刺激后，检测诱导CTL引发的能力。ELISA检测上清中IFN-γ的含量和胞内因子染色检测IFN-γ+ CD8+T细胞频率，qRT-PCR检测perforin和Grz B mRNA的表达水平。(8)肿瘤治疗模型:建立B16-OVA肺转移模型，检测WH-OVA靶向后增强OVA257-264抗原的抗肿瘤活性。检测肺转移灶数目。脾细胞用OVA257-264再刺激5天后，ELISA检测上清中IFN-γ的含量和胞内因子染色检测IFN-γ+CD8+T细胞频率，qRT-PCR检测perforin和Grz BmRNA的表达水平。
　　结果:
　　1.通过p3×FLAG-mClec9a-CTLD质粒转染HEK-293T真核表达系统获得了3mg高纯度的mClec9a-CTLD蛋白。
　　2.以mClec9a-CTLD为靶蛋白经过5轮的噬菌体肽库淘选，得到了4个富集的噬菌体克隆。通过phage ELISA实验验证了这4个噬菌体克隆可以很好的与mClec9a-CTLD亲和。
　　3.利用Fmoc标准固相合成技术合成了mClec9a-CTLD的亲和肽和对照肽及其衍生物。
　　4.利用细胞因子Flt3L诱导骨髓细胞来源的DC，即FL-DC，通过流式细胞术检测表明FL-DC上Clec9a高表达，而利用GM-CSF/IL-4诱导的DC，即GM-DC，则不表达Clec9a。
　　5.利用生物素化的mClec9a-CTLD亲和肽与FL-DC的亲和性，通过流式检测，只有WH肽能够与FL-DC亲和(Kd≈2.27μM)。进一步通过过表达mClec9a的HEK-293T细胞系，WH肽具有很强的亲和性，而与转入空载体的细胞亲和作用不明显。
　　6.成功构建了pIRES2-mClec9a(mouse Clec9a isoform1 gene，795bp)质粒。利用QuickChange法成功突变了7个由甘氨酸替换的Clec9a单氨基酸突变体质粒，即 pIRES2-mClec9a R154A、pIRES2-mClec9a W155A、pIRES2-mClec9a M157A、pIRES2-mClec9a I160A、pIRES2-mClec9a D248A、pIRES2-mClec9a W250A和pIRES2-mClec9a Y252A。
　　7.通过PEP-FOLD预测了WH肽的3D结构和构象，然后利用ZDOCK将WH肽与mClec9a的晶体结构进行分子对接，获得了WH与mClec9a结合的两个主要区域，即S1和S2。Clec9a上的7个氨基酸残基(R14、W155、M157、I160、D248、W250和Y252)可能在与WH肽结合时具有关键作用。通过突变体亲和实验验证了只有D248和W250这两个氨基酸残基在与WH亲和中起着关键作用，计算机模拟显示D248和W250与WH肽上的Arg3和Phe4相互作用，其分子之间的距离小于4.5(A)。
　　8.通过DC/OVA257-264/OT-1交叉递呈模型，WH-OVA能够强烈刺激na(i)ve T细胞的增殖，促进IFN-γ的分泌，并且提高T细胞杀伤性分子perforin和Grz BmRNA的相对表达量。
　　9.将多肽与CpG ODN1826佐剂混合后皮下免疫C57BL/6J小鼠3次，每7天免疫一次，最后一次免疫后的第5天获取脾细胞，利用OVA257-264在体外刺激5天，WH-OVA能够明显地诱导CTL引发，促进IFN-γ的分泌，提高perforin和Grz B mRNA的相对表达水平。
　　10.在肺肿瘤转移模型中，抗原靶向后具有增强抗肿瘤免疫应答的能力，减少肺转移灶的数目，通过检测抗原再刺激脾细胞后的上清，发现IFN-γ的分泌量明显提高，同时也刺激perforin和Grz BmRNA的表达。
　　结论:
　　获得了3mg高纯度的mClec9a-CTLD真核蛋白，得到了4个与其亲和的噬菌体克隆;通过ELISA鉴定，这些噬菌体均和靶蛋白具有很好的亲和性。利用Fmoc合成了亲和肽:WH、IH-biotin、WH-biotin、SR-biotin、RW-biotin和WH-OVA;对照肽以及其衍生物:GA-biotin、GA-OVA和OVA257-264。WH肽能亲和FL-DC或过表达的mClec9a细胞，并且能特异性地亲和到mClec9a的D248和W250氨基酸残基上。利用MST实验证明了WH肽以及衍生物具有很好的亲和mClec9a的能力（Kd为约2μM），而对照肽GA肽则不具备亲和靶蛋白mClec9a的能力(Kd值为1602μM)。WH肽在体外能够增强抗原的交叉递呈作用和在体内外诱导CTL引发以及抗肿瘤的活性，说明WH具有很强的靶向运输和增强抗肿瘤免疫反应的能力。

目录

声明

摘要

英文缩写一览表

引言

第一章 mClec9a-CTLD蛋白表达与纯化

1．1 实验材料与方法

1．1．1 主要试剂

1．1．2 主要仪器

1．1．3 细胞株和质粒

1．1．4 方法

1．2 实验结果

1．2．1 利用HEK-293T细胞表达mClec9a-CTLD蛋白

1．3 讨论

第二章 利用噬菌体展示肽库技术筛选mClec9a-CTLD的亲和肽

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．1．3 常用培养基和溶液配制

2．2 实验过程与方法

2．2．1 固相亲和淘选流程

2．2．2 噬菌体扩增

2．2．3 噬菌体滴度的测定

2．2．4 亲和噬菌体克隆DNA序列测定和多肽序列分析

2．2．5 ELISA鉴定噬菌体克隆与蛋白mClec9a-CTLD的亲和性

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 筛选亲和mClec9a-CTLD的噬菌体

2．3．2 噬菌体克隆插入DNA序列测定与氨基酸序列分析

2．3．3 ELISA鉴定亲和mClec9a-CTLD阳性噬菌体

2．4 讨论

第三章 合成mClec9a-CTLD亲和肽

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 第一个氨基酸缩合反应

3．2．2 后续氨基酸缩合过程

3．2．3 切割

3．2．4 高效液相色谱法制备多肽和质谱鉴定

3．3 制备多肽和质谱鉴定结果

3．4 讨论

第四章 WH肽亲和实验和抗原交叉呈递实验

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．1．3 主要试剂配置

4．1．4 细胞系和质粒以及图谱

4．1．5 引物和mClec9a isoform 1 gene

4．1．6 实验动物

4．2 实验方法

4．2．1 FL-DC和GM-DC的诱导

4．2．2 流式检测FL-DC和GM-DC上Clec9a蛋白的表达情况

4．2．3 流式检测mClec9a亲和肽与FL-DC的亲和性

4．2．4 获取cDNA

4．2．5 构建pIRES2-mClec9a重组质粒

4．2．6 构建pIRES2-mClec9a单氨基酸突变体

4．2．7 计算机模拟WH肽与mClec9a相互作用模式

4．2．8 WH肽的亲和特异性

4．2．9 体外WH-OVA靶向到DC的交叉递呈实验

4．2．10 MST检测肽的亲和力

4．2．11 统计分析

4．3 实验结果

4．3．1 mClec9a-CTLD亲和肽与FL-DC和HEK-293TClec9a亲和实验结田7代

4．3．2 WH与mClec9a相互作用模式

4．3．3 WH特异性亲和

4．3．4 抗原靶向DC引起的交叉递呈作用

4．3．5 利用MST检测亲和肽以及衍生物与靶蛋白mClec9a的亲和力

4．4 讨论

第五章 WH肽体内免疫活性研究

5．1 实验材料

5．1．1 主要试剂

5．1．2 主要仪器

5．2 实验动物

5．3 实验方法

5．3．1 体外CTL引发实验

5．3．2 治疗性B16-OVA模型

5．3．3 ELISA检测上清中IFN-γ的含量

5．3．4 qRT-PCR检测perforin和GrzB mRNA的相对表达量

5．3．5 胞内因子染色检测IFN-γ

5．3．6 统计分析

5．4 实验结果

5．4．1 WH肽在体内增强OVA257-264抗原刺激特异性CTL的引发

5．4．2 WH肽增强OVA257-264抗原的抗肿瘤效应

5．5 讨论

全文讨论

全文结论

树突状细胞DC的功能以及基于DC疫苗的研究进展

参考文献

附录

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢