人胚胎干细胞源性心外膜细胞向心肌成纤维细胞诱导分化

摘要

心肌细胞约占心脏总体积的75％，但其细胞数量只占有心脏细胞总数的30%-40%。整个心脏约2/3细胞为非心肌细胞，其中绝大多数为心肌成纤维细胞（CF, cardiac fibroblast）。心肌成纤维细胞能够分泌细胞外基质（ECM）构成心脏骨架、传导机械-电信号、分泌因子促进心肌细胞增殖和冠状动脉血管生成等。在心肌损伤时，随着细胞因子侵袭、细胞死亡及炎性物质渗透，心肌成纤维细胞被激活转变成肌性成纤维细胞，从而导致细胞外基质合成和降解之间的平衡打破，细胞外基质的过度合成会导致纤维组织的发育形成瘢痕组织。因其受限于人类心脏组织的获取及无有效的心肌成纤维分离方法，对于心肌成纤维细胞在心脏发育及病理状态下功能的研究仅来源于模式研究。体外通过人胚胎干细胞(hESC,human embryonic stem cell)产生心肌成纤维细胞能够克服这种困难并提供无尽的细胞来源进行体外功能研究及体内模型试验，同时为心脏组织工程提供功能性心肌成纤维细胞奠定了基础。
　　心肌成纤维细胞主要来源于心外膜细胞。心外膜细胞来源于形成在心房心室环路形成时的前心外膜器官(PEO，proepicardial organ)。小鼠E10.5、禽类E3、人类发育第4周，心外膜细胞覆盖整个心脏表面。心外膜细胞覆盖整个心脏表层后，部分心外膜细胞进行上皮-间质转化（EMT, Epithelial-mesenchymal transition）形成心外膜源性细胞（EPDCs, epicardium-derived cells），并迁移侵袭至心肌细胞层，剩余细胞仍覆盖在心脏表面。迁移侵入到心肌细胞之间的EPDCs在多种信号通路作用下能够继续分化形成心肌成纤维细胞和血管平滑肌细胞等。心外膜细胞表达特异性标记因子WT1、ALDH1A2和TBX18等，进行EMT形成EPDCs后，其表达水平迅速降低并开始表达EMT标记因子SNAIL1和SNAIL2等，进一步分化形成心肌成纤维细胞表达其特异性标记因子TCF21、DDR2、COL1A1、TBX20、GATA4、POSTN、CD90、HAND2等。心肌成纤维细胞的发育过程受多种信号通路调控。研究表明TGFβ，PDGF，Wnt/β-Catenin等促进心外膜细胞进行EMT，Retinoic Acid，FGFs，VEGF等信号通路在EPDCs分化形成心肌成纤维细胞过程中起到重要的调控作用。目前，尚无研究能够在体外通过调节信号通路诱导分化形成功能性的人心肌成纤维细胞。
　　本研究以人胚胎干细胞为实验对象，在BMP4和CHIR-99021作用下将其诱导分化形成成熟心外膜细胞，进而研究TGF-β1、PDGFBB和IWP2对心外膜细胞行上皮-间质转化形成 EPDCs过程中的调控作用及 bFGF、PDGFBB和SB-431542协同促进 EPDCs分化形成心肌成纤维细胞的作用。建立两步诱导将人胚胎干细胞源性心外膜细胞定向诱导分化形成心肌成纤维细胞的体系，并对获得心肌成纤维细胞功能进行鉴定。
　　本课题针对以上相关问题从以下四个方面进行研究：第一部分：诱导分化人胚胎干细胞形成成熟心外膜细胞并对其进行鉴定，选取形成成熟心外膜细胞最佳时间，为进一步进行心肌成纤维细胞诱导分化提供正确稳定的细胞来源；第二部分：采用不同浓度TGF-β1、PDGFBB和IWP2作用于hESC源性心外膜细胞，选取出最有效促进EMT的浓度组合，并进一步探讨进行EMT的最佳时间；第三部分：在第二部分基础上，采用不同浓度bFGF、PDGFBB和SB-431542作用于 EPDCs，对形成细胞进行鉴定并探讨特异性形成心肌成纤维细胞的最佳浓度及时间；第四部分：利用已经建立的两步法特异性诱导hESC源性心外膜细胞分化形成心肌成纤维细胞，对其进行传代培养，观察其在传代过程中的稳定性并对其功能进行鉴定。
　　第一部分
　　研究目的：
　　诱导人胚胎干细胞分化形成心外膜细胞，为心肌成纤维细胞诱导分化提供细胞来源。
　　研究方法：
　　采用HESC2-RFP（NIH code ES02）细胞系诱导分化形成心外膜细胞。D0-D1， hESCs在BMP4作用下分化成拟胚体。D1-D4，拟胚体在BMP4和Activin A作用下诱导分化成心脏中胚层。D4-D6，心脏中胚层在BMP4和CHIR-99021特异性诱导分化下形成心外膜前体细胞（P-epi）。D6-D15，心脏中胚层持续分化增殖形成前体心外膜细胞。D15-D27，前体心外膜细胞增殖形成成熟心外膜细胞(EPI， epicardium)。利用WT1、ALDH1A2和TBX18等心外膜细胞特异性标记因子从细胞分子水平、mRNA表达水平和蛋白表达水平对其进行鉴定。在D15,D21,D24,D27分别取心外膜前体细胞和心外膜细胞，对其特异性标记的表达水平进行检测，选取成熟心外膜细胞形成的最佳时期。同时，相同方法分化形成心脏中胚层，D4-D6，VEGF和IWP2特异性诱导心脏中胚层分化为心肌细胞（CM）作为对照。
　　结果：
　　1. D15 CM,D15 P-epi和D27 EPI表达Aldeflour的阳性细胞率分别为8.64%，16.9%和93.6%；WT1阳性细胞率分别为12.0%,35.9%和90.4%；CD90阳性细胞率分别为17.6%，62.3%和79.9%；cTNT阳性细胞率分别为72.4%，19.6%和8.5%；
　　2. D15 P-epi和D27 EPI在mRNA水平上表达WT1、ALDH1A2、TBX18、ISL1、CD90、BNC1、ANA8、GPM6A、UPK1B、KRT8和 KRT19等心外膜标记因子，而D15 CM低表达。D15 CM、D15 P-epi和D27EPI均表达TCF21、GATA4和GATA5。相比较于D15 CM表达心肌细胞标记因子TNNT2和MEF2C，D15 P-epi和D27 EPI细胞不表达；
　　3.免疫荧光结果显示D27 EPI细胞核中表达WT1,细胞质中不表达cTNT。CD15 CM细胞质中表达cTNT，细胞核中不表达WT1；
　　4. D27 EPI高表达心外膜特异性标记因子，是诱导分化形成成熟心外膜细胞的最佳时期。
　　结论：
　　人胚胎干细胞在BMP4和CHIR-99021作用下，特异性诱导分化形成成熟心外膜细胞。诱导分化形成心外膜细胞稳定表达心外膜特异性标记因子，为进一步建立心肌成纤维诱导分化体系提供了基础。
　　第二部分
　　研究目的：
　　研究TGF-β1、PDGFBB和IWP2是否能够共同作用调控hESC源性心外膜细胞的上皮-间质转化
　　研究方法：
　　采用人胚胎干细胞诱导分化形成心外膜细胞为研究对象，不同浓度TGF-β1(0ng/ml、0.1ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、3ng/ml)，联合不同浓度PDGFBB（0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、30ng/ml）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry从mRNA水平和细胞分子水平检测心外膜细胞标记因子的表达，进行上皮间质转化的细胞会失表达。1ng/ml TGF-β1和1ng/ml PDGFBB组为最佳，但其分化效率有限。在此基础上，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和不同浓度IWP2（0μM，0.1μM，0.3μM，1μM，3μM，5μM）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry从mRNA水平和细胞分子水平检测心外膜细胞标记因子的表达，进行上皮间质转化的细胞会失表达。同时，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB分别和100ng/ml Wnt3a，100ng/ml Wnt5a，150ng/ml DKK1,0.5μM CHIR-99021作用72h对IWP2协同促进EMT作用进行验证。1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2组分化效率最高，达到90%以上。从细胞形态学角度，观察上皮-间质转化后细胞形态变化。为了确定EMT最佳时期，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2组分别作用于hESC源性心外膜细胞24h、48h和72h，通过RT-PCR和Flow cytometry从mRNA水平和细胞分子水平检测心外膜细胞标记因子表达水平的变化。免疫荧光染色进一步证实TGF-β1、PDGFBB和IWP2联合作用有效促进hESC源性心外膜细胞经EMT转化成EPDCs。
　　结果：
　　1.单独采用TGF-β1可促进hESC源性心外膜细胞行EMT，但细胞数量会明显下降。1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB联合作用能够促进 EMT，但其分化效率有限；
　　2.1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2为诱导EMT的最佳浓度组合，分化效率达90%以上。Wnt3a，Wnt5a和CHIR-99021不能促进EMT；
　　3.1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2作用后，从形态学上，卵圆形心外膜细胞转化为细长形间质细胞；
　　4.48h为1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2诱导EMT的最佳时间；
　　5.免疫荧光结果显示经过EMT得到的EPDCs不表达WT1、ZO1和α-SMA，而表达Vemitin。
　　结论：
　　TGF-β1、PDGFBB和IWP2联合作用48h能够有效促进hESC源性心外膜细胞进行EMT。
　　第三部分
　　研究目的：
　　研究bFGF、PDGFBB和SB-431542是否能够共同作用调控hESC源性心外膜细胞形成的EPDCs特异性分化形成心肌成纤维细胞
　　研究方法：
　　采用 hESC源性心外膜细胞经EMT后形成的EPDCs为研究对象。在添加和不添加SB-431542的条件下，采用不同浓度bFGF(0ng/ml、3ng/ml、10ng/ml)，联合不同浓度PDGFBB（0ng/ml、10ng/ml、30ng/ml）作用72h。RT-PCR从mRNA水平上观察WT1、ALDH1A2、CD90、MYH11、TCF21和EPOR表达变化。添加SB-431542的条件下，3ng/ml bFGF和10ng/ml PDGFBB组为诱导分化形成心肌成纤维细胞的最佳浓度。进而，采用不同浓度SB-431542（0μM，0.1μM，0.3μM，1μM，3μM，6μM）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry从mRNA水平和细胞分子水平检测心肌成纤维细胞标记因子的表达。3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB组为诱导EPDCs分化形成心肌成纤维细胞的最佳组合。为了确定心肌成纤维细胞诱导分化最佳时间，3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-431542组分别作用于 EPDCs24h、48h和72h，通过 RT-PCR和 Flow cytometry从mRNA水平和细胞分子水平检测特异性心肌成纤维细胞标记因子的表达水平。免疫荧光染色进一步证实bFGF、PDGFBB和SB-431542联合作用有效诱导EPDCs分化形成心肌成纤维细胞。
　　结果：
　　1.3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-431542组诱导分化形成细胞表达心肌成纤维细胞标记因子 CD90、DDR2、POSTN、Col1A1、TCF21、HAND2、EPOR和GATA4等，不表达WT1、ALDH1A2和MYH11；
　　2.3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB诱导分化形成心肌成纤维细胞中CD90+Aldeflour-细胞占66.5%；
　　3.72h为3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-431542诱导EPDCs分化形成心肌成纤维细胞的最佳时间；
　　4.诱导分化形成心肌成纤维细胞形态学上为梭形，单个或多个细胞核；
　　5.免疫荧光结果显示诱导分化得到心肌成纤维细胞不表达 WT1、ZO1和α-SMA，而表达Vemitin。
　　结论：
　　在bFGF、PDGFBB和SB-431542联合作用72h下，hESC源性心外膜细胞形成的EPDCs有效分化形成心肌成纤维细胞。
　　第四部分
　　研究目的：
　　研究hESC源性心外膜细胞在体外诱导分化形成的心肌成纤维细胞，是否能够进行传代培养，传代培养过程中其特性是否发生改变及对其功能进行鉴定。
　　研究方法：
　　采用 hESC源性心外膜细胞经过两步法诱导分化形成的心肌成纤维细胞为研究对象。待细胞密度达到80%-90%时，进行传代培养，多次重复此步骤。通过RT-PCR和Flow cytometry从mRNA水平和细胞分子水平检测心肌成纤维细胞特异性标记因子表达水平。免疫荧光检测其在蛋白水平表达心肌成纤维细胞标记因子的表达情况。将传代培养获得成熟心肌成纤维细胞与人胚胎干细胞诱导分化形成心肌细胞以不同比率共同培养，观察其相互作用。
　　结果：
　　1.诱导分化形成心肌成纤维细胞能够稳定传代，第二代时标记因子表达水平最高；
　　2.心肌成纤维细胞传代过程中保持形态学上细长或者梭形，单个或多个细胞核；
　　3.不同代数心肌成纤维细胞CD90+Aldeflour-细胞百分比均在80%以上；
　　4.不同代数心肌成纤维细胞在mRNA水平均表达CD90、DDR2、POSTN、Col1A1、TCF21、HAND2和GATA4等，不表达WT1、ALDH1A2，低表达MYH11；
　　5.免疫荧光结果显示不同代数心肌成纤维细胞均不表达 WT1、ZO1和α-SMA，而表达Vemitin；
　　6. hESC源性心外膜细胞表面不表达EPOR，而不同代数心肌成纤维细胞表面表达EPOR，阳性细胞百分率达50%以上；
　　7.传代心肌成纤维细胞能够促进心肌细胞增殖，最佳共培养比率为心肌成纤维细胞：心肌细胞=2：1。
　　结论：
　　hESC来源心外膜细胞经两步法诱导分化形成心肌成纤维细胞能够稳定传代并促进心肌细胞增殖。

目录

声明

中英文缩略词表

引言

1 心肌成纤维细胞特性及其发育过程

2 心肌成纤维细胞发育过程中相关信号通路

第一部分 人胚胎干细胞向心外膜细胞诱导分化

1.1 研究背景

1.2 材料与方法

1.3 结果

1.4 讨论

第二部分 TGFβ-1、PDGFBB和IWP2协同促进hESC源性心外膜细胞行上皮-间质转化

2.1 研究背景

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三部分 bFGF、PDGFBB和SB-431542共同作用特异性诱导EPDCs分化为心肌成纤维细胞

3.1 研究背景

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四部分 hESC源性心外膜细胞诱导分化形成心肌成纤维细胞的传代及功能测定

4.1 研究背景

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

参考文献

本文小结

本文创新点

综述一:心外膜细胞特性及其在心脏发育和修复中作用

综述二:心肌成纤维细胞特性及在心脏中作用

个人简历

在学期间发表的论文

致谢