基于DNA模板化铜纳米簇的生物传感新方法研究

摘要

金属纳米簇由于其独特的性能如生物相容性、低毒性、发射波长可调、光稳定性以及高量子产率等，越来越多的受到科研工作者的青睐。目前，金属纳米簇主要以牛血清蛋白蛋白、还原性物质、树枝状大分子、微生物细胞等为模板来合成，而寡核苷酸链由于其特有的分子识别、自组装性能以及优良的纳米尺寸效应等特点，也是一种优良的金属纳米簇的模板。以寡核苷酸链为模板的铜纳米簇由于其制备方法简单、成本低、生物相容性好、绿色环保等优点，而受到人们的广泛关注，但其应用仍然处在初级阶段，因此铜纳米簇还有很大的发展空间和广阔的应用前景。本论文主要以DNA为模板合成的铜纳米簇为出发点，开展了一系列的研究工作。主要研究思路如下：
　　首先，基于三磷酸腺苷（ATP）与其适配体特异性识别的作用，结合富T碱基为模板的荧光铜纳米簇的聚集荧光增强效应，我们设计了一种免标高灵敏检测ATP的新方法。本方法中，我们用富T碱基序列将两段被裂分开的ATP适配体进行延伸，当有ATP存在的情况下，ATP与其适配体结合形成适配体1-ATP-适配体2的复合物，从而将两段可以作为铜纳米簇模板的富T碱基序列拉近，而富T碱基序列能作为模板合成铜纳米簇，同时产生明显的荧光增强效应，且体系的荧光强度随着 ATP浓度的增加而增强。基于此，本文建立了一种操作简单、选择性高、成本低的高灵敏检测ATP的方法，线性范围为100 nM-100μM，检测限为10.29 nM。在此基础上，进一步实现了复杂生物体系中ATP的检测，为ATP在分子生物学和生物医学诊断中提供了一种新型的检测方法。
　　其次，基于以发夹状富T碱基为模板的铜纳米簇，我们发展了一种“turn-off”型免标检测T4多聚核苷酸激酶的新方法。少于15个T碱基的DNA序列不能被用作铜纳米簇合成的模板，除非其位于发夹状结构的环状区域。T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）将DNA的5端磷酸化，基于此，结合λ核酸外切酶对5端为磷酸基团的双链 DNA的识别及消解作用，我们提出了一种简单快速的检测 T4 PNK的新方法。在没有T4 PNK存在的情况下，λ核酸外切酶不能消解5端为羟基的发夹状探针，因此能够形成荧光铜纳米簇。当有T4 PNK存在的情况下，发夹状探针的5端羟基被磷酸化，并被λ核酸外切酶识别消解，发夹状的DNA探针被打开形成直链状的DNA，因此不能有效的合成铜纳米簇，体系的荧光信号大大降低。基于此，本文建立了一种简单易行，绿色环保，成本低廉的检测T4 PNK的方法，线性范围是0.1-20 U/mL，检测限为0.1 U/mL。与文献报道的方法具有一定的可比性，在生物医学领域和临床诊断领域有很大的应用前景。
　　最后，基于双链DNA模板化的铜纳米簇为检测信号，我们设计了一个“turn-on”型的检测T4多聚核苷酸激酶和其抑制剂的新方法。该方法中，我们设计了一个5端突出，3端凹陷并被磷酸化的发夹状探针，一旦发夹状探针3端的磷酸基团被T4多聚核苷酸激酶（T4 PNKP）水解为羟基，就能够在Klenow Fragment（KF）聚合酶的聚合作用下，延伸生成双链DNA，并作为铜纳米簇的模板合成荧光铜纳米簇。基于此，本文实现了对T4 PNKP活性的检测，线性范围为0.1-25 U/mL，检测限为0.067 U/mL，并且对T4 PNKP抑制剂的检测也取得了较好的实验结果。该方法简单、免标、易行，在T4 PNKP的测定及其相关领域中具有很大的应用前景。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 金属纳米簇概述

1.2 金属纳米簇的制备

1.3 金属纳米簇在传感体系中的应用

1.4 本论文拟开展的工作

第二章 基于以富T碱基序列为模板的铜纳米簇的荧光增强效应高灵敏检测ATP

2.1 前言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 基于以发夹状富T碱基为模板的铜纳米簇对T4 PNK的检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 基于双链DNA为模板的铜纳米簇对T4 PNKP及其抑制剂的检测

4.1 前言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 总结

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢