氯美噻唑抑制CYP2E1预防二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化

摘要

肝纤维化(liver fibrosis)是临床常见的慢性进行性疾病,由一种或多种病因长期反复作用形成弥漫性肝损害,包括病毒、酒精、肝毒性药物及外源性毒物、自身免疫性疾病等,表现为肝内结缔组织异常增生和肝内细胞外间质成分过度异常地沉积,影响肝脏的功能。
　　细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)是一类含有亚铁血红素蛋白的超家族代谢酶,主要参与多种内源性物质(如脂肪酸、类花生四烯酸以及甾醇类)和外源性物质(如亚硝胺类、醇类、药物等)的I相生物转化,其中CYP2E1是参与上述各物质代谢最重要的酶类。二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)是N-亚硝胺家族的典型致癌物,它广泛存在于日常生活接触的多种物质中。DEN在CYP2E1催化下首先发生a-羟基化反应生成a-羟基烷基亚硝胺,a-羟基烷基亚硝胺分解产物与DNA结合,形成DNA烷基加合物,最终导致肝脏损伤,因此DEN广泛用于大鼠肝纤维化以及肝癌模型的建立。
　　氯美噻唑(clomethiazole,CMZ)是硫胺素噻唑啉衍生化合物,有镇静、催眠、抗焦虑的作用,在欧洲一些国家广泛用于酒精戒断症状包括震颤性谵妄的治疗。CMZ作为CYP2E1的抑制剂,对人体代谢氯唑沙宗具有显著的抑制作用。由于CYP2E1在多种物质的毒代动力学和药代动力学中有重要作用,因此CMZ可以作为抑制剂用于阐述体内CYP2E1在异生型物质活化和代谢中的重要作用,进一步可用于研究抑制CYP2E1代谢小分子毒物诱发的肝脏疾病。
　　本研究所前期研究证明肝癌患者肝纤维化组织CYP2E1的活性显著升高,可导致DEN产生更多的致癌物诱导肝脏损伤,那么有必要考察抑制CYP2E1对DEN的代谢对肝纤维化病理发展程度的影响。
　　本研究拟以大鼠为研究对象,建立DEN诱导的大鼠肝纤维化模型,以CMZ为CYP2E1抑制剂,研究CMZ对正常及肝纤维化大鼠DEN毒代动力学的影响,并探讨CMZ对DEN诱导的大鼠肝纤维化病理进程的影响,以期为临床肝纤维化的预防和治疗提供新的思路和途径。
　　方法：
　　1.氯美噻唑（CMZ）对二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　1.1.大鼠血浆中二乙基亚硝胺（DEN）浓度的测定
　　血浆中DEN选用高氯酸进行蛋白沉淀，DEN样品的浓度测定选用HPLC-UV法。所建立的测定方法在一定范围内呈现较好的线性关系（r2>0.999），日间、日内变异均小于15％，回收率在85%～115%之间，不同放置条件下稳定性良好，说明所建立的分析方法符合生物样本的测定要求。
　　1.2.氯美噻唑（CMZ）对正常大鼠二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　采用自身对照实验，选取12只正常雄性 SD大鼠分别考察单用 DEN（50mg/kg，i.p）毒代动力学和高（100mg/kg，i.p）、中（50mg/kg，i.p）、低（10mg/kg， i.p）剂量CMZ联合DEN（50mg/kg，i.p）对毒代动力学的影响，分别于用药前、用药后1、4、10、25min及1、2.5、4.5、7、10、24、48 h眼眶采血0.3ml，分离血浆保存于-30℃待测。
　　1.3.氯美噻唑（CMZ）对肝纤维化大鼠二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　采用自身对照实验，选取10只DEN诱导的肝纤维化大鼠，于肝纤维化模型12周时分别考察单独DEN（50mg/kg，i.p）毒代动力学和CMZ（50mg/kg，i.p）联合DEN（50mg/kg，i.p）对肝纤维化大鼠DEN毒代动力学的影响。
　　2.氯美噻唑（CMZ）对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠肝纤维化模型的影响
　　2.1.大鼠肝纤维化模型的建立
　　雄性SD大鼠44只随机分成5组，空白对照组（n=10）、DEN诱导模型组（50mg/kg，i.p. n=10）、CMZ高（100mg/kg，i.p. n=8）、中（50mg/kg，i.p. n=8）、低（10mg/kg，i.p. n=8）剂量干预组。DEN模型组前4周每周两次DEN给药，第5周至第12周每周一次DEN给药。CMZ干预组，除首次单用DEN给药外，前4周每周两次CMZ联合DEN给药，第5周至第12周每周一次CMZ联合DEN给药。
　　2.2.氯美噻唑（CMZ）在大鼠肝纤维化模型建立过程中对二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　CMZ干预组给药期间分别于第一周首次DEN给药和首次CMZ联合DEN给药时考察不同剂量CMZ对大鼠DEN毒代动力学的影响，在12周肝纤维化时期考察不同剂量CMZ联合DEN给药对大鼠DEN毒代动力学的影响，采血量及时间同上。各实验组大鼠于12周处死，留取肝脏标本用于病理检测分析。
　　2.3.氯美噻唑（CMZ）对二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝纤维化的影响
　　分别计算以上各实验组大鼠肝脏指数（肝重/体重）；采用HE和Masson染色的方法对肝标本病理检测分析，并依据Ishak评分系统对各组病理结果进行评分；采用免疫组化的方法分别检测肝标本增值细胞核抗原（PCNA）、细胞增殖指数（Ki-67）的阳性表达率以及胎盘型谷胱甘肽硫转移酶（GST-P）的光密度值。
　　2.4.氯美噻唑（CMZ）对CYP2E1的抑制作用与大鼠肝纤维化的相关性
　　分别统计各剂量组大鼠CMZ抑制后毒代动力学参数（AUC0-t，AUC0-∞，CL）与上述大鼠肝纤维化指标（Ishak评分、Masson）的相关性。
　　3.统计方法
　　采用SPSS21.0统计软件对各项数据资料进行统计学分析。毒代动力学参数的计算采用Das2.1进行计算。各项数据进行正态性检验，对非正态分布的数据，采用非参数检验进行相关分析，检验水准a为0.05。
　　结果：
　　1.氯美噻唑（CMZ）对二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　1.1.氯美噻唑（CMZ）对正常大鼠二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　与对照组（单次DEN）比较，CMZ低、中、高剂量分别使DEN清除率CL下降（44.49±10.16）%、（58.35±9.14）%、（69.35±5.03）%，半衰期 t1/2分别延长（89.82±121.70）%、（317.64±128.80）%、（438.32±127.51）%，曲线下面积AUC0-t分别扩大（80.12±32.85）%、（117.83±45.71）%、（192.37±47.77）%，曲线下面积AUC0-∞分别扩大（88.97±44.88）%、（127.58±43.27）%、（218.21±51.27）%，分布容积Vd中、高剂量扩大（70.60±50.71）、（64.87±42.44）%（P<0.05）。而峰浓度 Cmax和达峰时间 Tmax无明显改变（P>0.05），提示不同剂量 CMZ明显改变了DEN在大鼠体内的毒代动力学。结果显示，CMZ对大鼠体内CYP2E1代谢DEN有显著的抑制作用，呈现较好的剂量依赖关系。
　　1.2.氯美噻唑（CMZ）对肝纤维化大鼠二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　肝纤维化大鼠CMZ抑制后毒代动力学参数与抑制前相比，Cmax扩大（38.17±16.50）%、AUC0-t扩大（168.46±35.96）%、AUC0-∞扩大（385.60±174.39）%、t1/2延长（189.00±173.95）%、CL下降（64.32±10.02）%（P<0.05），结果提示CMZ对肝纤维化大鼠代谢DEN有明显的抑制作用。
　　2.氯美噻唑（CMZ）对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠肝纤维化模型的影响
　　2.1.氯美噻唑（CMZ）对二乙基亚硝胺（DEN）诱导肝纤维化模型的影响
　　CMZ干预组和模型组大鼠的体重较对照组均显著性下降（P<0.05），但CMZ干预组和模型组四组间大鼠体重的变化无统计学差异。CMZ干预组较模型组大鼠肝脏明显呈现数量较少、体积较小的硬化结节。
　　CMZ干预组和模型组大鼠的肝脏指数、Ishak评分、Masson染色阳性面积百分比、PCNA阳性面积百分比、Ki-67阳性面积百分比、GST-P光密度值均高于对照组（P<0.05）。CMZ干预组肝标本 Masson染色阳性面积百分比、PCNA阳性面积百分比、Ki-67阳性面积百分比均低于模型组（P<0.05），但CMZ干预组GST-P光密度值与模型组无统计学差异（P>0.05）。
　　高剂量组CMZ肝标本Ishak评分低于模型组（P<0.05）。高剂量组CMZ肝标本Ishak评分、肝脏指数和Masson染色阳性面积百分比较低剂量组均显著下降（P<0.05）。高剂量组CMZ肝标本Ishak评分和Masson染色阳性面积百分比均低于中剂量组（P<0.05）。中剂量组CMZ肝标本PCNA阳性面积百分比较低剂量组有所升高（P<0.05）。肝脏指数和 Ishak评分在模型组与 CMZ中、低剂量组间无统计学差异，Ki-67阳性面积百分比在CMZ高、中、低剂量组间无统计学差异，GST-P光密度值在以上四组间均无统计学差异（P>0.05）。
　　结果表明，CMZ的预防用药显著减少了大鼠肝脏纤维化的病变程度。
　　2.2.氯美噻唑（CMZ）在大鼠肝纤维化模型建立过程中对二乙基亚硝胺（DEN）毒代动力学的影响
　　CMZ各剂量干预组在大鼠正常时期，低剂量 CMZ抑制后 DEN的 AUC0-t扩大（139.90±40.77）%、AUC0-∞扩大（142.81±42.13）%、t1/2延长（260.95±121.88）%、CL下降（57.79±6.83）%（P<0.05）；中剂量CMZ抑制后DEN的 AUC0-t扩大（269.63±50.40）%、AUC0-∞扩大（270.21±50.38）%、t1/2延长（349.22±121.25）%、CL下降（72.57±3.72）%（P<0.05）；高剂量 CMZ抑制后DEN的AUC0-t扩大（428.89±56.72）%、AUC0-∞扩大（453.43±68.26）%、t1/2延长（522.32±443.48）%、CL下降（81.69±2.25）%（P<0.05）；
　　CMZ各剂量干预组在大鼠肝纤维化时期，低剂量 CMZ抑制后毒代动力学参数较正常时期CMZ抑制后毒代动力学参数相比，AUC0-t扩大（45.63±38.58）%、AUC0-∞扩大（60.50±54.83）%、t1/2延长（63.29±82.17）%、CL下降（29.83±28.38）%（P<0.05）；中剂量CMZ抑制后毒代动力学参数较正常时期CMZ抑制后毒代动力学参数相比，AUC0-t扩大（61.60±24.46）%、AUC0-∞扩大（100.18±60.74）%、t1/2延长（136.85±130.47）%、CL下降（45.90±16.06）%（P<0.05）；高剂量CMZ抑制后毒代动力学参数较正常时期CMZ抑制后毒代动力学参数相比AUC0-t扩大（61.62±19.73）%、AUC0-∞扩大（62.77±76.86）%、t1/2延长（218.50±250.04）%、CL下降（25.54±34.50）%（P<0.05）。
　　结果显示高、中、低剂量CMZ均显著抑制了大鼠在正常及肝纤维化时期体内CYP2E1对DEN的代谢。
　　2.3.氯美噻唑（CMZ）对CYP2E1的抑制作用与大鼠肝纤维化的相关性
　　CMZ抑制后大鼠毒代动力学参数AUC0-t与Ishak纤维化评分（R=-0.511、P=0.011）以及Masson染色阳性面积百分比（R=-0.514、P=0.010）呈显著的负相关；毒代动力学参数AUC0-∞与Ishak纤维化评分（R=-0.511、P=0.011）以及Masson染色阳性面积百分比（R=-0.447、P=0.028）呈显著的负相关；清除率CL与Ishak纤维化评分（R=0.428、P=0.037）以及Masson染色阳性面积百分比（R=0.407、P=0.049）呈显著的正相关。
　　结果显示，各CMZ干预组大鼠CMZ抑制后DEN体内暴露量与肝纤维化程度呈负相关，清除率呈正相关。随着CMZ剂量的增加，CMZ对大鼠体内DEN的代谢抑制作用越明显，DEN所诱导的大鼠肝纤维化程度就越轻。进一步表明， DEN通过CYP2E1的代谢而诱导了大鼠的肝纤维化，CMZ通过抑制CYP2E1的活性明显减轻了DEN诱导的肝纤维化程度。
　　结论：
　　1. CMZ的干预显著降低了大鼠的肝纤维化程度，并呈现剂量依赖性。2. CMZ显著抑制了正常及肝纤维化大鼠体内CYP2E1对DEN的代谢。3. CMZ对大鼠肝纤维化的预防作用与CMZ对CYP2E1的抑制作用有显著的相关性，CMZ通过抑制CYP2E1有效减轻了DEN诱导的肝纤维化。

目录

声明

中英文对照缩略词表

前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 氯美噻唑（CMZ）对DEN毒代动力学的影响

2 CMZ对DEN诱导的大鼠肝纤维化模型的影响

讨论

1 CYP2E1在肝纤维化形成中的重要性

2 CMZ对CYP2E1的抑制作用探讨

3 CMZ对DEN诱导的大鼠肝纤维化模型的影响

结论

参考文献

综述:CYP2E1在药物代谢和病理进程中的重要作用及CYP2E1抑制剂对相应病理进程的影响

个人简历及在研期间发表论文

致谢