二甲双胍促进记忆性T细胞分化及增强其抗肿瘤效应的机制研究

摘要

研究背景和目的
　　免疫治疗作为《科学》杂志评出的2013年十大突破之首，表现出对抗肿瘤的巨大潜力，也使之成为继外科手术、放疗、化疗之后第四类已被证明具有显著优势的抗肿瘤疗法。其中，过继性细胞免疫治疗已经成为癌症治疗的重要手段之一，并在临床试验中取得了显著的治疗效果。嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells, CAR-T）治疗作为过继免疫治疗的新兴力量，使T细胞能够特异且有效地杀伤肿瘤细胞，显著改善患者的预后。
　　然而，无论是传统的过继免疫细胞疗法还是新型的CAR-T疗法，都尚未在实体瘤治疗中取得突破性进展。究其原因，一方面由于肿瘤微环境的存在影响T细胞的活化和代谢：（1）T细胞活化后抑制性受体上调，而肿瘤细胞通过表达相应配体抑制 T细胞功能；（2）微环境中的肿瘤细胞竞争性摄取葡萄糖，抑制 T细胞的糖酵解，进而抑制 T细胞的分化和记忆性的形成。另一方面，由于体外扩增培养的 T细胞大多处于终末分化状态，难以在患者体内发挥持续、长久的抗肿瘤效应。如何获得分化状态低、抗肿瘤能力强的 T细胞是目前过继性细胞免疫治疗领域研究的热点。因此，探讨记忆性 T细胞分化的机制，获得更多年轻化T细胞用于免疫治疗的研究十分必要。
　　记忆性T细胞是一群异质性细胞，包括干细胞样T细胞（T memory stem cell, Tscm）、中心记忆性 T细胞（central memory cell, Tcm）和效应记忆性 T细胞（effector memory cell, Tem）等。其中Tscm和Tcm亚群在体内的增殖和抗肿瘤活性均优于Tem和效应性T细胞（effector T cell, Teff）。代谢检测点和信号通路分子是调控记忆性 T细胞分化过程的关键因素。因而，探讨如何通过体外药物诱导干预获得记忆性T细胞的研究已成为当前热点。AMPK是促进记忆性T细胞形成的关键信号通路分子，也是T细胞重要的代谢检测点，而临床II型糖尿病的一线用药二甲双胍（metformin）能够显著激活AMPK通路。二甲双胍杀伤肿瘤细胞的研究已有报道，但是二甲双胍能否通过激活AMPK促进记忆性T细胞形成及增强其抗肿瘤效应的机制尚不清楚。
　　肺癌在我国发生率和死亡率逐年增长，使得肺癌超越其他恶性肿瘤成为致死率第一的肿瘤。尽管手术、化疗、放疗和靶向治疗等治疗手段和方案取得了较大进展，但是肺癌患者的5年生存率仅为16.1％。目前，肺癌已经发展成为我国公共健康的焦点问题。尽管CAR-T细胞治疗在实体瘤中取得了一定的疗效，但是尚未有关于肺癌治疗的研究。此外，CAR-T细胞的持久性及记忆性影响其在体内的生存和抗肿瘤效应。因而，我们将以肺癌为模型探讨二甲双胍能否促进CAR-T细胞的记忆性，增强CAR-T治疗肺癌的效果。
　　本文主要探讨了二甲双胍通过激活AMPK信号通路，抑制miR107的表达进而增加转录因子Eomes的表达水平，促进记忆亚群Tscm和Tcm细胞比例上调。同时，二甲双胍促进记忆性CAR-T细胞的形成及增强体、内外对肺癌细胞的杀伤能力。进一步验证二甲双胍改善肺癌合并糖尿病患的预后，促进体内记忆性细胞的形成，为临床过继性细胞免疫治疗提供新的思路和实验依据。
　　实验方法
　　1）流式细胞术检测患者来源的CD8+ T细胞中各亚群的比例、表面标志物表达和胞内因子的分泌水平。
　　2）流式细胞术检测体外培养时二甲双胍对 CD8+T细胞分化和分泌胞内因子水平的影响。
　　3）细胞免疫荧光分析二甲双胍对CD8+T细胞PD-1表达的影响。
　　4）采用Annexin-V/PI双染法检测二甲双胍对CD8+T细胞凋亡的影响。流式分选Tscm和Tcm亚群，采用qRT-PCR检测抗凋亡基因Bcl2和Bcl6的表达水平。
　　5）qRT-PCR法检测T细胞分化相关基因和microRNA的表达水平。
　　6）Western blot检测相关信号通路蛋白的表达。
　　7）双荧光报告实验验证miR107与Eomes的靶向关系。
　　8）利用海马能量检测系统分析T细胞的糖酵解水平。
　　9）构建靶向HER2抗原的CD8+CAR-T细胞，分析二甲双胍对HER2-CAR T细胞分化和抗肿瘤活性的影响。
　　10）流式细胞术检测二甲双胍处理的HER2-CAR T细胞对HER2高表达的靶细胞（A549和H460）以及HER2低表达的结直肠癌细胞系HCT-116的杀伤作用。
　　11）对肺癌合并糖尿病患者进行生存分析，探讨二甲双胍对肺癌患者预后的影响。
　　12）流式细胞术检测肺癌患者外周血及肿瘤浸润的CD8+T细胞亚群比例、表面标志物的表达及胞内因子的分泌水平。
　　13）采用免疫组化分析肿瘤浸润T细胞的PD-1表达水平。
　　实验结果
　　1）二甲双胍在体内促进记忆性 T细胞形成。服用二甲双胍后糖尿病患者CD8+Tscm和Tcm亚群比例增加。
　　2）二甲双胍在体内增强T细胞功能。服用二甲双胍后，糖尿病患者CD8+T细胞表面PD-1和Tim-3的表达水平降低，IFN-??和IL-2的分泌水平增强。
　　3）体外培养中二甲双胍处理增加了记忆性CD8+ T细胞比例。二甲双胍处理3d和7d时，Tscm和Tcm亚群比例升高。
　　4）二甲双胍抑制CD8+T细胞的凋亡。二甲双胍上调CD8+ T细胞及Tscm和Tcm细胞亚群抗凋亡基因Bcl2和Bcl6的表达水平。
　　5）二甲双胍上调与记忆性相关基因如 Eomes和 AMPK的表达，降低与效应性相关基因如Prdm1和T-bet的表达。转录因子Eomes的表达水平在二甲双胍处理的T细胞中显著升高。
　　6）二甲双胍激活AMPK信号通路，抑制其下游mTOR及S6通路。
　　7）AMPK抑制miR107上调Eomes的表达。
　　8）二甲双胍降低CD8+T细胞糖代谢水平，有利于记忆性的形成和维持。
　　9）二甲双胍促进记忆性HER2-CAR T细胞的形成。HER2-CAR转染T细胞效率达到70%以上，并上调Tscm和Tcm亚群的比例。
　　10）二甲双胍增强 HER2-CAR T细胞的抗肿瘤效应。二甲双胍能够增加HER2-CAR T细胞表达脱颗粒标志物 CD107a的水平。同时促进 IFN-??和 IL-2的分泌、增强HER2-CAR T细胞杀伤A549和H460的能力，而对低表达HER2的结直肠癌细胞系HCT-116的杀伤功能较弱。
　　11）建立肺癌移植瘤模型，对荷瘤小鼠进行治疗发现，二甲双胍处理的HER2-CAR T细胞清除肿瘤效果更好。
　　12）二甲双胍促进肺癌患者记忆性 T细胞的形成。服用二甲双胍的患者生存时间较对照组患者延长7个月以上，且外周血CD8+T细胞及TIL细胞中Tscm和Tcm亚群比例均较对照组Tscm和Tcm比例增加。
　　13）二甲双胍降低肺癌患者T细胞表面PD-1的表达。服用二甲双胍的患者外周血及肿瘤浸润的CD8+T细胞PD-1的表达水平均降低。
　　14）二甲双胍增强促炎性细胞因子的分泌水平。二甲双胍组患者外周血及肿瘤浸润的CD8+T细胞分泌的IFN-??和IL-2的水平均较对照组患者显著增加。
　　结论
　　1）二甲双胍通过AMPK-miR107-Eomes通路促进记忆性T细胞形成；在培养体系中加入二甲双胍，能够获得肿瘤清除能力更强、生存时间更长的 CAR-T细胞，为记忆性T细胞的临床应用提供了可能。
　　2）二甲双胍能够促进患者体内记忆性CD8+ T细胞的形成，有助于改善预后，为肿瘤免疫治疗提供了新思路。

目录

声明

中英文缩略词

前言

第一部分 二甲双胍对T细胞分化的影响及机制研究

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二部分 二甲双胍促进CAR-T向记忆细胞的分化及抗肿瘤效应

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第三部分 二甲双胍通过影响T细胞分化和功能改善肺癌患者预后

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

全文小结

参考文献

综述:T细胞分化及其抗肿瘤效应的研究现状

个人简历

博士期间发表的学术论文

博士期间所获专利及参加的项目和学术会议

致谢