miR-202-3p靶向调控YAP1对黑素细胞的生物学影响及分子机制研究

摘要

本课题目的在于筛选出白癜风患者血清中差异miRNAs的表达谱，利用生物信息学分析预测差异miRNAs的功能分布，然后通过建立体外细胞模型研究差异表达的miRNAs(miRNA-202-3p)对黑素细胞生物学功能的影响，并探究其在发挥作用的分子机理。本研究试图探求miRNAs在白癜风发病中的作用，进一步在基因层面深入对白癜风发病机制的了解，为该病的早期诊断提供新的可能的分子标志物，同时也为治疗白癜风的新药开发提供可能的分子靶点。本课题包括以下三部分:
　　第一部分:白癜风患者外周血miRNAs的表达及靶基因预测和功能分析
　　方法：
　　1.使用miRNeasy Mini Kit提取白癜风患者血清中的miRNA，然后利用NanoDrop ND-2000定量总RNA，并经Agilent Bioanalyzer2100检测RNA完整性。
　　2.通过高通量测序和芯片杂交技术检测白癜风患者血清中的miRNAs，然后使用Feature Extraction软件处理原始图像提取原始数据，接着利用Genespring软件进行quantile标准化和后续处理，利用T检验的P值和倍数变化值进行差异miRNAs筛选。
　　3.分别用TargetScan，PITA，microRNAorg数据库对差异miRNA进行靶基因预测，取共同的miRNAs进行后续的非监督层次聚类分析、GO富集分析和KEGG通路分析。
　　4.使用Cytoscap软件绘制差异表达miRNAs靶基因调控网络图。
　　5.使用qRT-PCR法验证白癜风皮损组织和正常皮肤组织中差异miRNAs的表达。
　　6.Fontana-Masson银染法检测白癜风皮损组织和正常皮肤组织中黑素合成情况。
　　7.免疫组化法检测Hippo信号通路中关键分子YAP1在白癜风皮损组织组中的表达。
　　结果：
　　1.所有样品的2100RIN值≥7.0，并且28s/18s≥0.7，结果表明实验所提取的样品合格，完整性好，没有发生降解。
　　2.与对照相比，白癜风患者血清差异表达miRNAs共34个，其中显著上调表达有2个，显著下调有32个。
　　3.差异miRNAs中，共有863个靶基因共同存在TargetScan，PITA，microRNAorg数据库中，差异表达miRNAs的生物功能主要集中于轴突导向、细胞黏附和细胞连接等相关的信号通路中，其中miRNA-202-3p上调最为显著并参与了Hippo信号通路。
　　4.miRNA调控靶基因互作网络图显示hsa-miR-202-3p和hsa-miR-630调控共同靶基因数量最多包括YAP1，CCNJ,GNG2，CPEB4，TFAP2B，B4GALT4和FBXO30。
　　5.与对照组相比，白癜风皮损组织中miRNA-202-3p表达显著上调，与高通量测序结果一致。
　　6.Fontana-Masson银染法检测白癜风皮损组织和正常皮肤组织中黑素合成情况，结果显示白癜风皮损组织的表皮黑色素完全脱失。
　　7.在正常皮肤组织中，YAP1呈现高表达，而在白癜风皮损组织中，YAP1呈现弱表达，两组相比有显著性差异。
　　第二部分:过表达或沉默miR-202-3p对黑素细胞生物学功能的影响
　　方法：
　　1.miRNA-202-3p过表达慢病毒载体构建:将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体和以HEK293细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增的miRNA-202-3p用EcoR1和NotⅠ进行双酶切，连接miRNA-202和过表达载体，构建miRNA-202-3p过表达慢病毒载体质粒Lenti-miR-202-3p，并进行转化和菌落PCR鉴定，送上海生工生物工程有限公司进行基因测序。
　　2.miRNA-202-3p干扰慢病毒载体构建:设计和合成miR-202-3p干扰序列，将退火片段连接入pLenti-hU6-GFP-Puro慢病毒载体中，构建miRNA-202-3p干扰慢病毒载体质粒pLenti-si-miRNA-202-3p重组质粒，并进行转化和菌落PCR鉴定，送上海生工生物工程有限公司进行基因测序。
　　3.慢病毒颗粒包装:将慢病毒表达载体质粒、pCMV-△8.2和pCMV-VSV-G质粒共转染至293T细胞中，48h后进行荧光观察，72h后收获携带目的基因的病毒，然后使用高速离心法纯化和浓缩慢病毒颗粒。
　　4.目的慢病毒颗粒对人黑素细胞PIG1细胞感染效率的检测:通过荧光显微镜观察慢病毒感染PIG1细胞48h后GFP表达和qRT-PCR法检测细胞中miRNA-202-3p的表达。
　　5.MTT法和流式细胞术分别检测miR-202-3p对人黑素细胞株PIG1细胞增殖和凋亡的影响。
　　6.多巴氧化反应法和氢氧化钠裂解法分别检测人黑素细胞株PIG1细胞酪氨酸酶活性和细胞内黑素含量。
　　7.使用纤维连接蛋白包被的培养板测定黑素细胞黏附率变化情况。
　　结果：
　　1.pLenti-miRNA-202-3p和pLenti-si-miRNA-202-3p慢病毒表达载体菌落PCR和基因测序结果显示，其分子大小及序列与NCBI中的参考序列一致，结果表明miRNA-202-3p过表达和干扰慢病毒载体质粒pLenti-miRNA-202-3p和pLenti-si-miRNA-202-3p构建成功。
　　2.荧光观察发现，慢病毒载体质粒、pCMV-△8.2和pCMV-VSV-G质粒共转染至293T细胞的效率达到90％以上，可用于下一步实验。
　　3.观察和测定PIG1细胞的感染效率，结果发现慢病毒感染目的细胞的效率达90％以上，qRT-PCR检测结果显示，pLent-miR-202-3p细胞中miR-202-3p表达显著增加，而pLent-si-miR-202-3p细胞中miR-202-3p表达显著减少，可以进行后续的实验。
　　4.MTT实验结果显示与对照组相比，miR-202-3p过表达显著抑制黑素细胞的生长，而降低miR-202-3p表达对人黑素细胞的增殖能力无显著影响，流式细胞术检测结果发现与对照组相比，miR-202-3p表达上调后细胞早期凋亡比例明显上升，而miR-202-3p表达下调对细胞凋亡无明显影响。
　　5.过表达miR-202-3p能够显著抑制细胞内酪氨酸酶活性和黑素合成，miR-202-3p表达下调显著增加细胞内酪氨酸酶的活性和黑素的合成。
　　6.miR-202-3p表达上调显著抑制了黑素细胞黏附作用，而miR-202-3p表达下调对黑素细胞与纤维连接蛋白的黏附作用无明显影响。
　　第三部分:miR-202-3p对黑素细胞生物学影响的分子机制研究
　　方法：
　　1.使用在线软件预测miR-202-3p的靶基因为YAP1，双荧光素酶报告实验验证YAP1是否是miR-202-3p的靶基因。
　　2.qRT-PCR检测miR-202-3p对黑素细胞PIG1中YAP1，P73，PUMA mRNA水平表达的影响。
　　3.Western blot检测miR-202-3p对黑素细胞PIG1中YAP1，P73，PUMA蛋白表达的影响。
　　结果：
　　1.双荧光素酶报告实验结果表明miR-202-3p直接靶向负调控YAP1基因的表达。
　　2.在miR-202-3p过表达的PIG1细胞中YAP1和p73基因的表达显著减少，PUMA表达显著增加。而miR-202-3p表达下调的细胞中，YAP1和p73基因的表达显著增加，PUMA表达显著减少。
　　3.PIG1细胞中miR-202-3p表达上调后，YAP1和p73蛋白表达明显下调，而PUMA蛋白表达显著增加;PIG1细胞中miR-202-3p表达下调后，YAP1和p73蛋白表达明显增加，而PUMA蛋白表达显著减少。
　　结论：
　　1.白癜风外周血清中有差异表达的miRNAs，包含2个显著上调表达miRNAs，32个显著下调miRNAs。差异表达miRNAs的生物功能主要集中于轴突导向、细胞黏附和细胞连接等相关信号通路中。差异表达最显著的miRNA-202-3p可能在白癜风的发生和发展中发挥重要作用。
　　2.过表达miR-202-3p可显著抑制人黑素细胞的增殖和细胞黏附作用，抑制黑素合成，促进细胞凋亡。沉默miR-202-3p可促进黑素合成，但对细胞增殖、黏附和细胞凋亡作用无明显影响。
　　3.YAP1是miR-202-3p直接靶向基因，miR-202-3p可能通过靶向调控YAP1的表达，影响细胞中增殖和凋亡相关蛋白p73和PUMA的表达，进而影响了正常人黑素细胞的生物学功能。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 白癜风患者外周血miRNAs的表达及其靶基因预测和功能分析

1 引言

2 实验材料

2．1 一般资料

2．2 主要试剂

2．3 主要仪器

2．4 主要试剂配制

3 实验方法

3．1 白癜风外周血清总RNA抽提和质量检测

3．2 芯片杂交

3．3 高通量测序数据分析和miRNAs靶基因预测

3．4 白癜风皮损组织切片和正常皮肤组织切片miRNA的提取

3．5 RNA浓度和质量检测

3．6 miRNA反转录

3．7 实时荧光定量PCR检测miR-202-3p表达水平

3．8 Fontana-Masson银染观察黑素情况

3．9 免疫组化检测白癜风皮损组织和正常皮肤组织中YAP1蛋白的表达

3．10 免疫组化对照设置

3．11 阳性结果判定标准

3．12 统计学分析

4 结果

4．2 白癜风患者血清miRNAs高通量测序结果

4．3 靶基因预测结果

4．4 miR-202-3p、miR-630、miR-766-3p和miR-1238-3p介导的基因调控网络

4．5 GO富集和KEGG信号通路分析

4．6 qRT-PCR验证白癜风患者皮损组织中miRNA-202-3p表达结果

4．6 白癜风皮损组织和正常皮肤组织中黑素合成情况

4．7 白癜风皮损组织和正常皮肤组织中YAP1表达

5 讨论

6 结论

参考文献

第二部分 过表达或沉默miR-202-3p对黑素细胞PIG1生物学功能的影响

1 引言

2 实验材料

2．1 细胞株

2．2 主要试剂

2．3 主要试剂配制

2．4 主要仪器

3 实验方法

3．1 miR-202-3p过表达载体构建

3．2 miR-202-3p干扰表达载体构建

3．3 慢病毒包装和感染黑素细胞株PIG1细胞

3．4 PIG1细胞稳定细胞系的冻存及复苏

3．5 实时荧光定量PCR检测miR-202-3p在各组细胞中的水平

3．8 多巴氯化法检测miR-202-3p对黑素细胞株PIG1酪氨酸酶活性的影响

3．11 统计学分析

4 结果

4．2 重组质粒pLenti-miR-202-3p序列测定

4．3 miR-202-3p干扰表达慢病毒载体构建

4．4 重组质粒pLenti-si-miR-202-3p序列测定

4．5 慢病毒包装结果

4．6 稳定PIG1-miR-202和PIG1-si-miR-202-3p细胞系的筛选

4．7 miR-202-3p对人黑素细胞株PIG1细胞增殖的影响

4．8 miR-202-3p对人黑素细胞株PIG1细胞凋亡的影响

4．9 miR-202-3p对人黑素细胞株PIG1细胞内酪氨酸酶活性和黑素合成的影响

4．10 miR-202-3p对黑素细胞株PIG1细胞黏附率的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

第三部分 miR-202-3p对黑素细胞PIG1影响的分子机制研究

1 引言

2 实验材料

2．1 细胞株

2．2 主要试剂

2．3 主要试剂配制

2．4 主要仪器

3 实验方法

3．1 双荧光泰酶报告基因载体构建

3．2 双荧光素酶报告实验

3．3 实时荧光定量PCR检测YAP1、p73和PUMA的表达水平

3．4 Western blot检测YAP1、p73和PUMA蛋白表达水平

3．5 统计学分析

4 结果

4．2 靶基因3’UTR序列的荧光素酶报告基因载体构建

4．3 重组质粒测序结果

4．4 双荧光素酶报告基因检测结果

4．5 qRT-PCR检测人黑素细胞PIG1细胞中YAP1、p73和PUMA的表达

4．6 Western blot检测人黑寨细胞PIG1细胞中YAP1、p73和PUMA蛋白的表达

5 讨论

6 结论

参考文献

全文总结

综述 白癜风研究现状及其与miRNAs关系的研究进展

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢