3p26.3染色体新型抑癌基因CHL1在食管鳞癌发生中分子机制及临床意义的研究

摘要

目的:
　　食管癌是最常见恶性肿瘤之一，在中国恶性肿瘤中跃居第四位，以鳞状细胞癌为主要病理类型。食管鳞状细胞癌(ESCC)的特征是高发病率和死亡率，严重危害人类健康。尽管多种治疗模式，如以手术治疗、放射治疗、化学治疗及免疫治疗的综合治疗，取得了显著的进展，但食管鳞癌的死亡率仍然很居高不下，5年生存率不超过15％[1]。
　　本研究中对食管鳞癌组织及其配对正常食管粘膜中CHL1基因的表达进行了检测，分析CHL1基因的表达与食管鳞癌发生发展及预后的关系;通过体内、体外实验明确CHL1基因生物学功能;通过蛋白质谱分析、免疫共沉淀(Co-IP)、免疫荧光(IF)及Western-blot研究其参与的信号传导通路，探讨CHL1基因的表达在食管鳞癌发生发展中所起到的作用。
　　第一部分 食管鳞癌患者组织中CHL1的表达及其临床意义
　　方法：
　　1)应用Real time PCR的方法检测基因CHL1mRNA在食管癌患者癌组织和配对正常食管粘膜中的表达。
　　2)应用免疫组化的方法检测食管癌患者癌组织和配对正常食管粘膜中CHL1蛋白的表达。
　　3)分析CHL1蛋白表达水平与临床病理特征之间的相关性。
　　4)分析CHL1蛋白表达水平与预后的相关性分析。
　　结果：
　　1)42例食管鳞癌患者中CHL1mRNA在癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织(3.1333±2.0746vs4.6547±5.4022)两组比较有统计学差异(t=3.085，P=0.0035)。其中有23例患者(57.1％)CHL1在癌组织中的表达较其配对正常组织表达下调。
　　2)食管鳞癌组织中CHL1表达阳性率为53.5％(154/288)，而癌旁正常食管粘膜CHL1蛋白表达阳性率为92.7％(267/288)，两者比较差异有统计学意义（x2=1.127，P＜0.001）。
　　3)CHL1蛋白的表达水平与患者的肿瘤细胞分化程度(x2=14.419，P=0.001)、局部侵袭程度（x2=3.965，P=0.049）、淋巴结转移（x2=10.883，P=0.001）和肿瘤TNM分期（x2=27.007，P=0.000）显著相关;而与患者的年龄、性别、肿瘤部位、大体分型无关(P＞0.05)。
　　4)Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示CHL1蛋白表达下调与生存时间显著相关(Log Rank=57.839，P=0.000);Cox风险回归分析表明CHL1表达下调可作为食管鳞癌患者总体生存的独立预后因素。
　　小结：
　　1)食管鳞癌患者的癌组织中CHL1mRNA和蛋白的表达显著低于配对癌旁正常组织，蛋白的表达水平与患者的临床病理特征中肿瘤细胞分化程度、局部侵袭程度、淋巴结转移和TNM分期相关。提示在食管鳞癌的发生发展过程中基因CHL1具有重要的作用。
　　2)CHL1蛋白的表达水平与食管鳞癌患者的生存显著相关，且是判断食管鳞癌患者预后的独立危险因素。
　　第二部分 CHL1在食管癌细胞中的生物学功能
　　方法：
　　1)采用RT-PCR和Western-blot方法检测食管癌细胞系及正常食管永生化细胞中CHL1的表达水平。
　　2)构建CHL1过表达食管癌细胞系及沉默内源性CHL1食管癌细胞系。
　　3)采用细胞生长曲线、平板克隆实验和软琼脂培养克隆实验等体外实验检测CHL1基因对食管癌细胞增殖的影响。
　　4)采用裸鼠皮下成瘤实验观察CHL1基因在体内对食管癌细胞成瘤性的影响。
　　5)采用流式细胞术检测CHL1基因对食管癌细胞周期的影响。
　　6)采用划痕实验、Transwell细胞迁移实验和细胞侵袭实验等体外实验检测CHL1基因对食管癌细胞侵袭、转移的影响。
　　7)构建NOD/SCID小鼠胭窝淋巴结转移模型，体内实验验证CHL1的表达抑制了食管癌细胞对转移的影响。
　　结果：
　　1)9种ESCC细胞系中的7种中检测到CHL1的下调，包括HKESC1，EC18，KYSE30，KYSE140，KYSE180，KYSE510和KYSE520，选择KYSE30和KYSE180构建CHL1稳定过表达ESCC细胞系。选择KYSE410构建CHL1稳定低表达的食管癌细胞系。
　　2)采用Real time PCR和Western blot的方法验证CHL1的过表达效率及沉默效率，即CHL1在过表达细胞系中mRNA和蛋白水平显著增高，在沉默CHL1的细胞系中表达降低。
　　3)细胞生长曲线、平板克隆实验和软琼脂培养克隆实验等体外实验细胞显示CHL1基因的表达显著抑制食管癌细胞的增殖。
　　4)裸鼠皮下成瘤模型中，CHL1基因的表达抑制裸鼠肿瘤的形成速度和肿瘤的体积。
　　5)CHL1基因的表达能够阻滞食管癌细胞的细胞周期于G1/S检验点。
　　6)划痕实验实验及Transwell细胞迁移实验和细胞侵袭实验结果显示CHL1基因抑制食管癌细胞迁移和侵袭能力。
　　7)NOD/SCID小鼠足底成瘤胭窝淋巴结转移模型，CHL1基因体内抑制食管癌细胞迁徙转移能力。
　　小结：
　　1)成功构建CHL1过表达食管癌细胞系和CHL1敲减食管癌细胞系。
　　2)在体外和体内证实了基因CHL1能抑制食管癌细胞的增殖和自我更新能力。
　　3)在体内和体外证实了基因CHL1能抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。
　　4)CHL1能够使食管癌细胞阻滞在细胞周期G1/S检验点。
　　第三部分 CHL1抑制食管癌细胞增殖及转移的分子机制研究
　　方法。：
　　1)采用Western blot方法检测CHL1的表达对食管癌细胞p53、p21和细胞周期蛋白的影响
　　2)采用Western blot方法检测CHL1的表达对食管癌细胞EMT的影响。
　　3)采用Rhodamin染色检测CHL1的表达对食管癌细胞骨架F-actin的影响;采用Co-IP和Western blot方法检测CHL1的表达对Rac1活化的影响。
　　4)采用免疫荧光染色瞬时转染CHL1的食管癌细胞系，检测CHL1对Merlin的招募作用。
　　5)采用Co-IP和Western blot方法检测CHL1/Np1复合物对Akt磷酸化的影响
　　结果：
　　1)CHL1的表达上调p21与p53表达，下调细胞周期蛋白cyclingD1和cyclingE的表达。
　　2)CHL1抑制上皮细胞向间质细胞转换(EMT)转化和通过降低活性Rac1的水平抑制F-肌动蛋白(F-actin)形成。
　　3)CHL1的表达招募Merlin从胞质到包膜的表达。
　　4)CHL1/Np1复合物抑制Akt磷酸化。
　　小结：
　　1)CHL1可能通过上调p21与p53表达，下调细胞周期蛋白cyclingD1和cyclingE的表达，使食管癌细胞阻滞在G1/S检验点。
　　2)CHL1基因的表达可以通过抑制食管癌细胞EMT转化，招募Merlin在细胞膜的表达，抑制Rho家族成员Rac1的活化抑制细胞骨架F-actin的形成而抑制食管癌细胞的转移。
　　3)CHL1与Np1相互作用形成复合物是抑癌基因SEMA3B通路中抑制Akt磷酸化所必要因素。
　　结论：
　　1)CHL1在食管鳞癌患者的肿瘤组织中表达显著下调，且与患者的临床病理特征中肿瘤细胞分化程度、pT分期、pN分期和预后相关，说明在食管鳞癌的发生发展过程中基因CHL1的表达缺失具有重要的意义。
　　2)CHL1的表达通过下调p53和p21的表达阻滞细胞周期在G1/S检验点，抑制食管癌细胞的增殖，迁移和侵袭的能力。
　　3)使用基于慢病毒的过表达和沉默的功能研究提供了直接支持CHL1作为具有抗增殖和抗转移能力的重要肿瘤抑制因子，通过Nf2和SEMA3B-Np1介导的AKT信号通路的抑制。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 食管鳞癌患者组织中CHL1的表达及其临床意义

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 CHL1的表达对食管癌细胞生物学行为的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 CHL1抑制食管癌细胞增殖及转移的分子机制研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

综述

个人简历

博士期间发表论文

致谢