产纤维素酶菌株S-1的筛选与诱变研究

摘要

纤维素是植物细胞壁的重要组成成分，利用纤维素酶系的水解作用，将其降解为容易被利用的葡萄糖。纤维素酶的应用对于解决全球性的能源、环境危机具有十分重要的意义，目前已成为全世界的研究热点。本研究从河南地区含有腐败秸秆的土样中筛选出具有产纤维素酶能力的菌株，根据刚果红染色后透明圈产生情况筛选出产纤维素酶能力较高的菌株S-1，并对其进行分子生物学鉴定，使用正交实验方法对菌株产酶条件进行优化;以菌株S-1为出发菌株，进行离子束及等离子体诱变，同时建立菌株纤维素酶活高通量筛选方法，选育纤维素酶高产突变菌株，并优化突变菌株的产酶条件。结果如下:
　　从河南地区含有腐败秸秆的土样中筛选7株具有产纤维素酶能力的菌株，其中菌株S-1经刚果红染色后所形成的透明圈直径与菌落直径的的比值(D/H)最高，为2.33，根据16S rRNA鉴定结果构建系统进化树，将菌株S-1鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
　　应用正交实验研究了不同因素（pH、温度、C源、N源）在不同水平下对菌株S-1发酵产CMC酶的影响。结果表明，在实验设定的因素水平范围内，菌株S-1的最适pH为5，最适温度为40℃，最适C源与N源含量均为15g/L。影响菌株S-1发酵产CMC酶的因素顺序为:温度＜C源＜pH＜N源。
　　将筛选到的菌株S-1进行离子束诱变，辐照剂量分别为1×1014、5×1014、1×1015、5×1015、1×1016、5×1016N+/cm2，发现剂量越大致死率越高，在离子束辐照剂量为5×1016N+/cm2时，致死率最高，达到100％，在辐照剂量为5×1014N+/cm2时，正突变率最高，为44％。
　　在功率为3.2W、辐照距离为3mm的条件下，应用等离子体对菌株S-1进行诱变，辐照时间分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20min，发现辐照时间越长致死率越高，在等离子体辐照时间为20min时，致死率最高，达到98.50％。
　　在离子束诱变产生的突变菌株筛选过程中，以诱变后突变菌株的CMC酶活为初筛指标，以突变菌株传5代的CMC酶活为复筛指标，筛选出20株突变菌株，其中突变菌株308的CMC酶活最高，接种24h后比出发菌S-1提高了84.4％。经传10代后，突变菌株308、D36、W10及D79的CMC酶活较为稳定，其中突变菌株308的CMC酶活最高，为16.83U/ml。突变菌株D36的CMC酶活为14.88U/ml。遗传稳定性实验的结果表明，突变菌株308、D79、D36、W10产CMC酶具有遗传稳定性。
　　菌体与芽孢的亚甲基蓝染色结果表明，传代培养第10代的出发菌株S-1与突变菌株308的菌体形态相似，均为杆状，但芽孢形态不同，出发菌株S-1与突变菌株308的芽孢分别为椭圆型和球型。
　　运用酶标仪高通量法测定出发菌株S-1、突变菌株308与D36的胞外CMC酶与胞内CMC酶活。结果表明，诱变前后菌株的胞内CMC酶活低于胞外CMC酶活，其中突变菌株308的胞内CMC酶活仅为5.94U/ml，胞外CMC酶活为16.69U/ml;出发菌株S-1的胞内CMC酶活为6.68U/ml，胞外CMC酶活为11.11U/ml。表明离子束诱变能够提高菌株胞外CMC酶的产量。
　　出发菌株S-1与突变菌株308、D36的生长曲线与产CMC酶曲线显示，与出发菌株S-1相比，突变菌株308与D36菌体增长速度较快，且菌体量较高。CMC酶产量均在菌株的对数期快速增长，在稳定期达到最高，且在一段时间内保持稳定，突变菌株308与D36的CMC酶产量均高于出发菌株S-1。
　　应用单因素实验研究培养温度、转速对突变菌株308产CMC酶的影响。最终确定了最佳培养温度为40℃，此条件下CMC酶活达到17.37U/ml;最佳转速为180r/min，此条件下CMC酶活达到19.56U/ml。

目录

声明

摘要

1 综述

1．1 纤维素与纤维素酶简介

1．1．1 葡聚糖内切酶

1．1．2 葡聚糖外切酶

1．1．3 β-葡萄糖苷酶

1．1．4 纤维素酶作用机理

1．1．5 影响纤维素酶活的因素

1．2 纤维素酶的来源

1．3．纤维素酶的应用

1．3．1 在畜牧生产与青贮饲料中的应用

1．3．2 在食品行业中的应用

1．3．3 纺织行业

1．4 纤维素酶的研究现状

1．4．1 自然选育

1．4．2 诱变选育

1．5 本研究的意义

2．纤维素酶产生菌的筛选、鉴定与产酶条件的优化

2．1 材料与方法

2．1．1 实验用材料

2．1．2 培养基和试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 纤维素酶产生菌的筛选

2．2．2 纤维素酶产生菌的保藏

2．2．3 纤维素酶产生菌的鉴定

2．2．4 酶标仪高通量CMC酶活测定法

2．2．5 菌株S-1产CMC酶条件的优化

2．3 结果和分析

2．3．1 产CMC酶菌株的筛选结果分析

2．3．2 产CMC酶菌株的鉴定

2．3．3 正交实验结果

2．4 结论

3．菌株S-1的离子束与等离子体诱变

3．1 材料与方法

3．1．1 实验用材料

3．1．2 实验试剂与培养基

3．1．3 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 离子束诱变与诱变突变菌株的分离

3．2．2 等离子体诱变与诱变突变菌株的分离

3．2．3 离子束诱变致死率与正负突变率的计算

3．2．4 等离子体诱变致死率的计算

3．2．5 突变菌株的初筛和复筛

3．2．6 突变菌株的菌体与芽孢形态

3．2．7 突变菌株遗传稳定性分析

3．2．8 突变菌株的胞内CMC酶测定

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株S-1的离子束诱变致死率与正突变率

3．3．3 离子束诱变后的菌落形态变化

3．3．4 离子束突变菌株的CMC酶活

3．3．5 离子束突变菌株308的形态学变化

3．3．6 出发菌株与突变菌株的胞内CMC酶与胞外CMC酶

3．3．7 突变菌株的遗传稳定性分析

3．4 讨论

4 菌株的生长曲线、产酶曲线与产酶条件的优化

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验溶液与培养基

4．1．3 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 菌株的生长曲线与CMC酶活测定

4．2．2 突变菌株308产CMC酶条件的优化

4．3 结果与分析

4．3．1 出发菌株S-1与突变菌株308、D36的酶活力曲线

4．3．2 出发菌株S-1与突变菌株308、D36的酶活力曲线

4．3．3 出发菌株S-1的菌密度(OD600)与CMC酶活力的关系

4．3．4 突变菌株D36的茵密度(OD600)与CMC酶活力的关系

4．3．5 突变菌株308的菌密度(OD600)与CMC酶活力的关系

4．3．6 突变菌株产CMC酶条件的优化

4．4 讨论

讨论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果