声明
摘要
1引言
1．1秸秆资源利用概述
1．1．1秸秆还田现状
1．1．2秸秆作为饲料原料
1．1．3秸秆作为生活燃料
1．1．4秸秆作为工业原料
1．1．5秸秆作为生物基料
1．1．6秸秆作为生物乙醇原料
1．2纤维素降解微生物
1．2．1纤维素降解真菌
1．2．2纤维素降解细菌
1．3纤维素酶命名及分类
1．3．1纤维素酶的命名方式
1．3．2纤维素酶的分类
1．4生物质预处理的主要方法
1．5微生物诱变育种
1．6纤维素酶的异源表达
1．6．1异源表达系统
1．6．2毕赤酵母表达宿主与表达载体
1．7研究意义与研究内容
1．7．1目的与意义
1．7．2研究内容
1．7．3技术路线
2材料与方法
2．1实验材料
2．1．1采集土壤样品
2．1．2采集生物质
2．1．3菌株与质粒
2．2试验药品和试剂
2．2．1试验仪器药品
2．2．2试剂的配制
2．3产纤维素酶菌株的筛选
2．3．1菌株的初筛方法
2．3．2菌株的复筛方法
2．4纤维素酶活力的测定
2．4．1葡萄糖标准曲线的测定
2．4．2纤维素酶活力测定方法
2．5产纤维素酶菌株的鉴定
2．5．1形态学鉴定方法
2．5．2分子生物学鉴定方法
2．6菌株产纤维素酶的条件优化
2．6．1碳源的测定
2．6．2氮源的测定
2．6．3发酵接种量的测定
2．6．4发酵温度的测定
2．6．5发酵初始pH值的测定
2．6．6发酵时间的测定
2．7纤维素酶的最适水解条件测定
2．8纤维素酶对离子液体耐受能力的测定
2．9离子液体预处理秸秆方法
2．10纤维素酶水解秸秆方法
2．11纤维素降解菌的诱变方法
2．11．1菌悬液的制备
2．11．2菌株的诱变
2．12β-glucosidase的异源表达
2．12．1菌体的活化
2．12．2菌丝的收集
2．12．3RNA的提取
2．12．4去除DNA的反应
2．12．5反转录反应
2．12．6引物设计
2．12．7目的基因的PCR扩增
2．13表达载体pPIC9K-β-glucosidase的构建与验证
2．13．1载体pPIC9K与目的基因的单酶切
2．13．2载体pPIC9K与目的基因连接
2．13．3重组扩增载体pPIC9K-β-glucosidase的扩增与验证
2．13．4重组毕赤酵母的构建
2．14重组β-glucosidase活力的测定
3结果与分析
3．1纤维素降解菌株的筛选
3．1．1纤维素降解菌株的初筛
3．1．2纤维素降解菌株的复筛
3．2菌株的形态学和分子生物学鉴定
3．2．1菌株的形态学鉴定
3．2．2菌株的分子生物学鉴定
3．3葡萄糖标准曲线的绘制
3．4菌株产纤维素酶条件优化结果
3．4．1碳源的优化
3．4．2氮源的优化
3．4．3接种量和发酵初始温度的优化
3．4．4发酵初始pH和发酵时间的优化
3．5菌株的诱变结果
3．5．1菌株诱变的初筛结果
3．5．2菌株诱变的复筛结果
3．5．3突变菌株产纤维素酶能力
3．5．4优势突变菌株的稳定性
3．6纤维素酶最适水解条件的测定
3．6．1野生菌株和突变菌株纤维素酶水解pH
3．6．2野生菌株和突变菌株纤维素酶水解温度
3．7纤维素酶耐受离子液体能力的测定结果
3．8离子液体预处理协同纤维素酶水解玉米秸秆
3．9pPIC9K-β-glucosidase的构建
3．9．2表达载体pPIC9K-β-glucosidase的构建
3．9．3重组毕赤酵母的筛选与诱导表达
3．9．4毕赤酵母重组子的筛选
3．9．5β-glucosidase的活性测定
4讨论
4．1高产纤维素酶菌株的筛选
4．2培养条件对菌株产纤维素酶能力的影响
4．2．1碳源和氮源的影响
4．2．2接种量和发酵温度的影响
4．2．3初始pH值和发酵时间的影响
4．3纤维素降解菌的诱变育种
4．4纤维素酶最适水解pH和温度
4．5纤维素酶对离子液体的耐受能力
4．6离子液体预处理协同纤维素酶水解秸秆
4．7纤维素酶的异源表达
5结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
东北农业大学;
