一株产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2及其筛选和培养方法

摘要

本发明公开了一株高产纤维素酶的镰刀菌YL2（Fusariumsp.），保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号为CCTCC？M？2014551；产纤维素酶的镰刀菌所用发酵培养基组成：纤维素粉40g/L、蛋白胨10g/L、KNO

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2。本发明还涉及该镰刀菌YL2的筛选和培养方法，其具有较好的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和微晶纤维酶活。

背景技术

纤维素是植物体的主要组成成分，约占植物体干重的33.4~50%，据估计，全世界平均每年大约可以生成近1000亿吨的植物纤维素类物质。纤维素是由多个葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键相互连接而成的线性直链聚合大分子多糖，可以在多种水解条件下（如酸解、碱解、酶解等）连续断键、解聚，最终分解成为最小单元的葡萄糖。因此，在石油资源日益紧张的国际环境中，利用纤维素降解生产的生物燃料己受到普遍关注。但是纤维素很难被分解利用，如何将纤维素转化为能直接利用的资源和能源是摆在人们面前的一个难题。纤维素的降解有两条途径：化学法和生物酶法，化学法是指在酸或碱性环境下水解成低分子量的糖，但是产品纯度低、生产过程污染环境；生物酶法是通过纤维素酶等生物质降解纤维素，可克服化学法的缺点。纤维素酶（cellulase），又称纤维素酶系，属于糖苷水解酶，能水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖，是协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切β-1,4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，当这三种主要成分活性比例适当时，就能完成纤维素的降解。

利用微生物产生的纤维素酶降解纤维类物质，反应条件温和，易于控制，对环境无污染，有利于促进人类社会的可持续发展，尤其是在生物能源方面的应用前景广阔。纤维素酶的获得是通过纤维素酶产生菌的发酵来得到，而目前存在的问题是纤维素酶的酶活力不高，酶解效率低。选育优良菌种是提高纤维素酶活力的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种产酶能力强、酶活性高的纤维素酶产生菌。本发明要解决的另一个技术问题是纤维素酶产生菌的培养方法。

一株产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2，Fusarium sp.YL2,于2014年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，位于中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2014551。

本发明的纤维素酶产生菌具有较好的纤维素酶产酶能力，其具有较好的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和微晶纤维酶活。

一株产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2的筛选方法，其步骤为：

（1）菌种活化：

将出发菌株镰刀菌ATCC 11599转接PDA斜面培养基，28～32℃恒温培养3～4d；出发菌株镰刀菌ATCC 11599 ，Fusarium sp. ATCC 11599，购于美国模式培养物集存库ATCC；

选择生长良好的活化斜面菌种转接于装有种子培养基的三角瓶中，于28～33 ℃，200±20 rpm下振荡培养36 h；

吸取经培养的种子培养液在10000 rpm下离心5 min，弃上清液；

以生理盐水重新悬浮沉淀并将其转入带有玻璃珠的三角瓶内充分振荡混匀；

再用带有纱布的无菌漏斗过滤除去菌丝体，得分生孢子悬浮液；

（2）紫外线诱变处理：

取四份1╳10³cfu/mL的分生孢子悬浮液20 mL，置于四个带有转子的平皿中，再将平皿置于诱变箱中的磁力搅拌器上，打开皿盖，开启磁力搅拌器，转速为30 rpm，并将平皿置于紫外灯下方分别照射30 s、1 min、2 min、4 min、6 min后，关闭磁力搅拌器和紫外灯，盖上皿盖；

然后取紫外灯照射后的分生孢子悬浮液0.1 mL均匀涂布在平皿中的筛选培养基上，于30℃恒温箱中倒置培养96 h，观察平皿上是否出现蓝色透明水解圈以及水解圈的大小；

挑取平皿上产较大蓝色透明水解圈的菌落，进行摇瓶复筛，检测滤纸酶活，筛选出滤纸酶活最高的菌株作为亚硝基胍NTG诱变的出发菌株；

（3）亚硝基胍NTG诱变处理：

将步骤（2）筛选出的菌株按步骤（1）进行菌种活化处理，并制备成分生孢子悬浮液；

向1╳10³cfu/mL的分生孢子悬浮液中添加亚硝基胍溶液至亚硝基胍浓度为1 mg/mL（m/v），于30℃ 160 rpm下振荡培养30 min；

然后10000 rpm离心5 min，弃上清液收集菌体，用生理盐水洗涤离心5次以上，再用生理盐水重悬浮菌体至出发体积，取100 μL涂布在筛选培养基上；培养96 h后，观察平皿上蓝色透明水解圈直径与菌落的直径比，筛选出直径比大的为优秀菌株；

（4）复筛：

将步骤（3）中筛选的菌株分别接种到种子培养基中，在30℃下200 rpm振荡培养72 h，以5%的接种量接入发酵培养基中，30℃下200 rpm振荡发酵7d，离心，采用国家轻工行业标准QB 2583-2003检测发酵液中纤维素酶活，复筛出纤维素酶高产菌株镰刀菌YL2。

为了获得更好的技术效果，步骤（1）中，种子培养液离心分离后，加入生理盐水洗涤离心2-6次；步骤（2）中，所述紫外灯为30W，平皿放置离紫外灯20-30cm处，紫外灯发出波长为XX-XX nm的紫外线；所述紫外灯预先照射20 min稳定波长：所述PDA斜面培养基，含马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值为4.0~4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；所述筛选培养基，含马铃薯200g/L，葡萄糖40g/L，AZCL-HE-cellulose（Megazyme International Ireland, Ltd.） 1 g/L，琼脂20g/L，pH值为4.0~4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；所述种子培养基，含葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L，121℃高压蒸汽灭菌15min；所述发酵培养基，含纤维素粉40g/L、蛋白胨10g/L、KNO₃ 6g/L、硫酸铵 3 g/L、KH₂PO₄18 g/L、KCl1.6g/L、MgSO₄·7H₂O 1.2g/L、Tween-80 1.2 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、MnSO₄·6H₂O0.01g/L、CuSO₄·7H₂O 0.01g/L，pH值为4.0~5.0，121℃高压蒸汽灭菌15 min。

本发明还提供一株产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2的培养方法，其步骤为：

（1）菌种活化：

将高产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2转接至PDA斜面培养基培养，30℃培养3~5 d；

（2）种子培养：

选取生长良好的斜面作为种子，用接种针挑一块接入种子培养基中，于30℃，200±20 rpm振荡条件下培养3~4 d，制得种子液；

（3）发酵培养：

将获得的种子培养液以4~8% （v/v）接种量接种于发酵培养基中，在28~32℃下，200±20 rpm振荡培养7~9 d。

本发明与现有技术相比，采用该诱变育种方法降低了筛选的盲目性，有效简化了筛选过程，大大提高了诱变育种的工作效率。本发明利用复合诱变技术筛选获得一株纤维素酶高产菌株，具有较好的产纤维素酶能力，其其滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维酶活分别为10.65 IU/mL、101.38 IU/mL和3.33 IU/mL；比出发菌株的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维酶活分别提高了23倍、47倍、5倍。本发明的纤维素酶高产菌镰刀菌YL2以及所产生的纤维素酶在生物燃料、纺织、资源再生、食品发酵、饲料等多个行业具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例出发菌株ATCC 11599的蓝色透明水解圈；

图2为本发明实施例诱变菌株镰刀菌YL 2的蓝色透明水解圈。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

本发明提供一种纤维素酶产生菌，纤维素酶产生菌的分类命名为镰刀菌YL2，Fusarium sp.YL2，是由美国模式培养物集存库购买的镰刀菌ATCC11599（Fusarium sp. ATCC11599）经紫外和NTG复合诱变获得的突变株镰刀菌。本发明产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2（Fusarium sp.YL2）于2014年11月5日保藏于中国武汉的武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014551。

实施例2

实施例1所述产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2的筛选方法，其步骤为：

（1）菌种活化

将出发菌株镰刀菌ATCC 11599（Fusarium sp. ATCC 11599 ）转接PDA斜面培养基，28～32℃恒温培养3～4 d；出发菌株镰刀菌ATCC 11599 ，Fusariumsp. ATCC 11599，购于美国模式培养物集存库ATCC；

选择生长良好的活化斜面菌种转接于装有种子培养基的三角瓶中，于28～33℃ ，200±20 rpm下振荡培养36 h；

吸取经培养的种子培养液在10000 rpm下离心5 min，弃上清液；

以生理盐水重新悬浮沉淀并将其转入带有玻璃珠的三角瓶内充分振荡混匀；

再用带有纱布的无菌漏斗过滤除去菌丝体，得分生孢子悬浮液；

（2）紫外线诱变处理

取四份1╳10³cfu/ml的分生孢子悬浮液20 mL，分别置于四只带有转子的平皿（平皿直径90 mm）中，再将平皿置于诱变箱中的磁力搅拌器上，打开皿盖，开启磁力搅拌器，转速为30 rpm，并将其置于30 W紫外灯下方20 cm处分别照射30 sec、1 min、2 min、4 min、6 min后，关闭磁力搅拌器和紫外灯，将培养皿的盖子盖上；使用前，紫外灯预先照射20 min稳定波长；

然后取紫外灯照射后的分生孢子悬浮液0.1 mL分别均匀涂布在四只平皿中的筛选培养基上，于30℃恒温箱中倒置培养96 h，观察平皿上是否出现蓝色透明水解圈以及水解圈的大小；

挑取平皿上产较大的蓝色透明水解圈的菌落，进行摇瓶复筛，检测滤纸酶活，从中筛选出滤纸酶活最高的菌株作为下面亚硝基胍NTG诱变的出发菌株；

（3）亚硝基胍NTG诱变处理

将上述（2）筛选出的菌株按上述（1）进行活化并制备成分生孢子悬浮液（制备过程同上述（1）菌种活化步骤）；

向1╳10³cfu/mL的分生孢子悬浮液中添加亚硝基胍溶液至亚硝基胍浓度为1 mg/mL（m/v，亚硝基胍质量/分生孢子悬浮液体积），于30℃下160 rpm振荡培养30 min；

然后10000 rpm下离心5 min，弃上清液收集菌体，用生理盐水洗涤离心5次以上，再用生理盐水重悬浮菌体至出发体积；再取上述诱变后的菌液100 μL涂布在盛放于平皿的筛选培养基上；

培养96 h后，观察平皿上蓝色透明水解圈直径与菌落直径比筛选出优秀菌株；

（4）复筛：

将上述（3）中筛选的多株直径比大的菌株分别接种到种子培养基中，在30℃下200 rpm振荡培养72 h，以5%的接种量接入发酵培养基中，30℃下200 rpm振荡发酵7d，离心，采用国家轻工行业标准（QB 2583-2003）方法检测发酵液中纤维素酶活，复筛出纤维素酶高产菌株镰刀菌YL2。

本发明所述产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌诱变处理流程包括：

制备出发菌株的菌悬液→紫外诱变→根据菌落形态及蓝色透明圈初筛→发酵复筛→斜面保存→制作菌株的菌悬液→NTG诱变→根据蓝色透明圈大小及颜色深度进行初筛→发酵复筛→转接斜面保存，检验稳定性。

本发明利用特定的颜色反应能够判断一个菌株是否具有纤维素降解能力。微生物若分泌纤维素降解酶，就能与培养基中有效的指示剂发生反应，产生特异颜色——变色圈，这是筛选纤维素降解菌的有效方法。变色圈的面积实际上反映了纤维素降解酶对纤维素的降解能力，因此以菌落圈与变色圈直径比值 （d1/d2）为判断依据可以评价单位菌株分泌纤维素酶的能力，比值越小，说明单位菌株可能产生的酶作用能力越强。

实施例3

实施例1所述产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2的培养方法，其步骤为：

（1）菌种活化：将高产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2转接至PDA斜面培养基培养，30℃培养3~5 d；

（2）种子培养：选取生长良好的斜面作为种子，用接种针挑一块（大约1cm³）接入种子培养基中，于30℃下200±20 rpm振荡条件下培养3~4 d，制得种子液；

（3）发酵培养：将获得的种子培养液以4~8% （v/v）接种量接种于发酵培养基中，在28~32℃下，200±20 rpm振荡培养7~9 d。

镰刀菌YL2（Fusarium sp.）菌株的特性：

（1）菌体形态：在液体培养中开始数个菌体连成绳索状的主菌丝，伴随着第二菌丝生长逐渐形成枯枝状，最后菌体发生溶菌，形成类似酵母状态，菌株的繁殖方式类似于酵母的出芽生殖方式；

（2）菌落形态：菌落由最初白色渐渐转变浅黄色，菌落底部边缘由粉褐色变成红褐色；菌落呈圆形，中心隆起，表面光滑，湿润，生长后期有菌丝体产生；

（3）培养特征：28～33℃，200rpm下振荡培养3-5d后，培养液颜色呈棕色或红褐色；

（4）可以利用的碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、玉米粉、米糠等，上述碳源可以混合使用，也可单一使用；

（5）可以利用的氮源：牛肉膏、蛋白胨、米糠、玉米浆、硝酸钠、酵母膏、硫酸铵等，上述氮源可以混合使用，也可单一使用。

实施例4

1、纤维素酶特性检测分析

将实施例3培养的产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2（Fusarium sp. YL2）所获得的培养液于4℃，7000rpm下离心20min，上清液即为粗酶液；用于做酶特性检测分析。

（1）葡萄糖标准曲线的绘制

配制10 mg/mL葡萄糖母液，并分别稀释成1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 mg/mL的葡萄糖溶液样品。分别取上述浓度0.5 mL的葡萄糖溶液样品分别加入到 2.0 mL的 0.05 M pH4.8的柠檬酸钠缓冲溶液中，再加3 mL的DNS反应液，混匀，沸水浴加热10 min，冷却至室温。使用分光光度计测定OD_540nm。以OD_540nm为纵坐标，对应葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

DNS反应液配制：称取3，5—二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2 g和无水亚硫酸钠5 g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000 mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。

（2）滤纸酶活（FPase）测定

于15mL离心管内分别先后添加2.0 mL 0.05 M pH4.8柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL步骤1中获得的粗酶液。加热至50℃，添加一条M型滤纸（50mg,Whatman No1）浸没于液体中。将混合样品于50℃水浴反应60 min，立即添加3.0 mL DNS反应液混匀终止反应。沸水浴加热10 min后，冷却至室温。取0.66 mL颜色反应后的混合液，加入2.34 mL去离子水或蒸馏水，充分混匀。使用分光光度计测定OD_540nm。由标准曲线读取样品的葡萄糖含量。

（3）CMC酶活（CMCase）测定

添加0.5 mL步骤1中获得的粗酶液至15 mL离心管内。加热至50℃，添加2 mL的底物溶液（用0.05 M pH4.8的柠檬酸钠缓冲液溶解羧甲基纤维素（CMC-Na），制备2%羧甲基纤维素（CMC-Na）溶液），50℃水浴反应30 min。再添加3.0 mL的DNS反应液，混匀后，沸水浴加热10 min，冷却至室温。取0.66 mL颜色反应后的混合液，加入2.34 mL去离子水或蒸馏水，充分混匀。使用分光光度计测定OD_540nm。。由标准曲线读取样品的葡萄糖含量。

（4）微晶酶活（Avicelase）测定

于15mL离心管内先后添加2.0 mL 0.05 M pH4.8柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL步骤1中获得的粗酶液。加热至50℃，再向其中添加50 mg微晶纤维素（生工生物工程（上海）股份有限公司，CB0279），溶解，50℃水浴反应60 min后，立即添加3.0 mL DNS反应液混匀终止反应。沸水浴加热10min后，冷却至室温。取0.66 mL颜色反应后的混合液，加入2.34 mL去离子水或蒸馏水，充分混匀。使用分光光度计测定OD_540nm。由标准曲线读取样品的葡萄糖含量。

（5）纤维素酶活性定义：1mL酶液于50±0.5℃、pH为4.8的条件下，1分钟水解纤维素底物产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖量，为1个酶活单位（IU）。

2、诱变菌株YL 2产酶特性

使用美国马里兰州罗克韦尔市的美国模式培养物集存库ATCC保藏，保藏编号为ATCC 11599的菌株参照本实施例步骤1中的方法，重复进行滤纸酶活（FPase）测定、CMC酶活（CMCase）测定、微晶酶活（Avicelase）测定，并使用分光光度计测定OD_540nm。

镰刀菌YL2（Fusariumsp.YL2）在发酵培养基中能高产纤维素酶，其滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维酶活分别为10.65 IU/mL、101.38 IU/mL和3.33 IU/mL；比出发菌株的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、微晶纤维酶活分别提高了23倍、47倍、5倍。