食管鳞癌中Rictor表达水平与细胞对mTOR抑制剂敏感性的关系及分子机制

摘要

目的 探讨人食管鳞癌组织中Rictor、p-Akt表达及临床意义，并探讨食管鳞癌细胞中 Rictor表达水平与细胞对 mTOR 抑制剂（依维莫司和 PP242）敏感性的关系及分子机制。 方法 一、人食管鳞癌组织中Rictor、p-Akt表达及临床意义分析 通过免疫组化法检测150例食管鳞癌组织和正常食管组织中Rictor和p-Akt的表达情况，并使用卡方检验、Spearman 秩相关分析探讨二者在食管鳞癌中的临床意义。 二、下调Rictor表达后细胞对mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）敏感性的变化 1. 用Lipo3000TM将Rictor-shRNA和Control-shRNA转染ECa109细胞，并用嘌呤霉素筛选稳定表达 Rictor-shRNA 和 Control-shRNA的ECa109 细胞株（ECa109-Rictor-shRNA 和 ECa109-Control-shRNA），免疫印迹法检测两株细胞中Rictor的表达情况。 2. 采用CCK-8法检测mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）对ECa109和EC9706细胞增殖的影响，并计算mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）作用食管鳞癌ECa109、EC9706细胞24h和48h的IC50。 3. 分别用ECa109-Rictor-shRNA和ECa109-Control-shRNA细胞建立裸鼠移植瘤模型，检测mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）对不同Rictor水平肿瘤生长的影响。 4. 采用H&E染色法和TUNEL法检测裸鼠移植瘤组织中细胞形态和细胞凋亡情况。 三、下调Rictor表达后细胞对mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）敏感性变化的分子机制 采用免疫印迹法体内外检测下调Rictor后mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）对PI3K/Akt/mTOR通路中相关因子表达的影响。 结果 一、人食管鳞癌组织中Rictor、p-Akt呈阳性表达并具有显著的临床意义 食管鳞癌组织中Rictor及p-Akt的阳性表达率显著高于正常食管组织中的阳 性表达率，且二者与患者的TNM分期具有显著相关性；食管鳞癌组织中Rictor表达水平与p-Akt表达水平呈正相关。 二、下调Rictor表达后细胞对mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）敏感性增强 1. 成功筛选出稳定表达株 ECa109-Rictor-shRNA和ECa109-Control-shRNA。免疫印迹法结果显示与后者相比，前者细胞中Rictor表达明显降低。 2. CCK-8结果显示随着mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）浓度的增加及作用时间的延长，ECa109 和 EC9706 细胞的存活率明显下降。依维莫司作用ECa109细胞24 h和48 h的IC50分别为52.18±1.72 μM和19.04±1.28 μM，依维莫司作用EC9706细胞24 h和48 h的IC50分别为52.07±1.72 μM和17.07 ±1.23 μM。PP242作用ECa109细胞24 h和48 h的IC50分别为11.28±1.05 μM和4.07±1.61 μM，PP242作用EC9706细胞24 h和48 h的IC50分别为13.84 ±1.14 μM和3.46±0.54 μM。 3. 裸鼠移植瘤结果显示与 Control-shRNA 组相比，Rictor-shRNA 组和Control-shRNA+ mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）中肿瘤体积增加变慢，而Rictor-shRNA+ mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）组肿瘤体积增加最慢。与Control-shRNA+ mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）组相比，Rictor-shRNA+mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）组的肿瘤体积增加明显变慢。 4. H&E 染色法结果显示与 Control-shRNA 组相比，Rictor-shRNA 组和Control-shRNA+mTOR 抑制剂（依维莫司和 PP242）组中出现细胞皱缩和细胞核皱缩等与细胞凋亡相关的细胞形态，这种现象在 Rictor-shRNA+mTOR抑制剂（依维莫司和 PP242 ）组中更加明显。TUNEL 法结果显示与Control-shRNA组相比，Rictor-shRNA组和Control-shRNA+mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）组细胞凋亡率明显增加，而Rictor-shRNA+mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）组肿瘤细胞凋亡率最高。 三、下调Rictor表达后提高细胞对mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）敏感性的分子机制 免疫印迹法体内外结果均表明和Control-shRNA组相比，Rictor-shRNA组和PP242组中p-Akt（Ser473）和p-PRAS40（Thr246）的蛋白表达明显降低；依维莫司组中p-Akt（Ser473）和p-PRAS40（Thr246）的蛋白表达升高。与依维莫司组相比，Rictor-shRNA+依维莫司组细胞中p-Akt（Ser473）和p-PRAS40（Thr246）的蛋白表达明显降低。与PP242组相比，Rictor-shRNA+ PP242组细胞中p-Akt （Ser473）和p-PRAS40（Thr246）的蛋白表达明显降低。 结论 人食管鳞癌组织中Rictor和p-Akt（Ser473）异常激活并在食管鳞癌的发展中起重要作用；下调食管鳞癌细胞中Rictor表达能够提高细胞对mTOR抑制剂（依维莫司和PP242）的敏感性

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