利用CRISPR/Cas9技术构建CHO的糖基化酶CMAH和GGTA1基因突变细胞株

摘要

研究背景和目的 治疗性重组蛋白的生产是生物制药中重要的一部分，而重组糖蛋白用于治疗许多疾病。通常情况下，哺乳动物表达系统是生物制药的首选体系。中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞是最常用的哺乳动物细胞系，用其作为宿主，能产生接近人源糖蛋白糖基化的治疗性重组糖蛋白。人源细胞和 CHO细胞糖基化最大的不同就是 CHO 细胞有两个糖基化酶，α-1,3-半乳糖转移酶（α-1,3-Galactosyltransferase ，GGTA1 ）和胞苷酸 N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH），而这两个酶在人体中已经缺失。在用 CHO 细胞生产治疗性糖蛋白时，GGTA1 产生的α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose ，α-gal)和 CMAH 产 生的N- 羟 乙 酰 神 经 氨 酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）会引起人体的免疫反应。本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对CHO细胞进行遗传改造，构建了CMAH和GGTA1基因突变的CHO细胞株，希望改进治疗性重组糖蛋白的治疗安全性。 方法 1.生物信息学分析：在NCBI上查找中国仓鼠的CMAH和GGTA1基因序列，确定CMAH的CDS8和GGTA1的CDS9为目标序列，选择在线软件ZIFIT的CRISPR/Cas Nucleases，设计出CMAH和GGTA1的sgRNA。根据sgRNA序列位置设计Reporter序列。 2.构建载体：将合成的CMAH-sgRNA和GGTA1-sgRNA分别和pGL3-U6质粒进行酶切连接，CMAH-Reporter和GGTA1-Reporter分别和pmCherry-EGFP质粒进行酶切连接，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒DNA，酶切后进行琼脂糖电泳鉴定。 3.细胞转染：pGL3-U6-CMAH-sgRNA、pmCherry-EGFP-CMAH-Reporter、Cas9和pGL3-U6-GGTA1-sgRNA、pmCherry-EGFP-GGTA1-Reporter、Cas9用lip3000分别共转染 HEK293T 细胞，验证 sgRNA的切割效率。选择切割效率较高的pGL3-U6-CMAH-sgRNA 转染目的细胞 CHO-S。再选择切割效率较高的pGL3-U6-GGTA1-sgRNA转染CMAH基因突变的CHO-S细胞。 4.单细胞克隆筛选：通过流式细胞分选仪分选得到6株CHO-S单克隆细胞，选取CMAH基因突变的CHO-S单克隆细胞进一步突变GGTA1基因，经流式分选获得6株CHO-S单克隆细胞，并扩大培养。 5.突变细胞株基因测序分析：在靶序列两端设计PCR引物，提取CHO-S单克隆细胞基因组DNA，PCR扩增后进行sanger测序。 6.突变细胞株 mRNA 表达检测：提取目的细胞 RNA 并反转录成 cDNA，设计CMAH和GGTA1基因的Q-PCR引物，检测其基因mRNA的表达量。 7.目的基因表达：将含人促红细胞生长素（Erythropoietin ，EPO ）的载体pIRES-neo-EPO转染到CHO细胞突变株，western blot检测EPO的表达能力。 结果 1.应 用 CRISPR/Cas9 技 术 成 功 构 建 了 CMAH 基 因的切 割 载 体pGL3-U6-CMAH-sgRNA和报告载体pmCherry-EGFP-CMAH-Reporter。 2.应 用 CRISPR/Cas9 技 术 成 功 构 建 了 GGTA1 基 因的切 割 载 体pGL3-U6-GGTA1-sgRNA和报告载体pmCherry-EGFP-GGTA1-Reporter。 3.通过流式分选技术获得CMAH和GGTA1基因突变的单克隆CHO-S细胞。 4.突变株细胞1-5 均在CMAH基因99546bp 位置缺失一个碱基 C，在 GGTA1基因68384-68385 bp之间插入一个碱基T。 5.与野生型CHO-S细胞相比，突变株细胞1-5的CMAH和GGTA1基因mRNA的表达量明显降低。 6.与野生型CHO-S细胞相比，突变株细胞1-5具有更强的增殖能力，且能够表达EPO蛋白。 结论 1.应用CRISPR/Cas9技术成功构建了CMAH和GGTA1基因突变的CHO-S细胞亚系1-5。 2.突变株细胞1-5在增殖方面与野生型CHO-S存在异质性。 3.突变株细胞1-5能够表达目的糖蛋白。

目录

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