RAC1对下咽鳞癌增殖、侵袭影响的分子机制及其预后价值研究

摘要

本课题以此为出发点，首先检测RAC1在下咽鳞癌组织中的表达情况，分析其表达水平与下咽鳞癌患者临床病理特征及预后的关系;然后观察RAC1对下咽鳞癌细胞生物学行为的影响，并用裸鼠移植瘤模型评价RAC1对肿瘤生长的影响;最后探讨RAC1对下咽鳞癌调节作用的分子机制。以期为阐明下咽鳞癌发生发展机制提供新的思路，为RAC1作为下咽鳞癌患者的治疗靶点提供新的理论基础。
　　第一部分 RAC1在下咽鳞癌组织中的表达及其临床意义
　　目的：
　　检测RAC1在下咽鳞癌及癌旁组织中的表达情况，分析其表达水平与下咽鳞癌患者临床病理特征及预后的关系，初步探讨RAC1在下咽鳞癌发生发展中的作用。
　　方法：
　　1.应用qRT-PCR及Western blot技术检测下咽鳞癌及癌旁组织中RAC1mRNA及蛋白的表达情况，应用免疫组织化学技术检测93例下咽鳞癌组织切片中RAC1蛋白的表达情况。
　　2.分析RAC1表达水平与下咽鳞癌患者临床病理特征之间的关系，应用Kaplan-Meier生存曲线分析RAC1对下咽鳞癌患者的预后价值，应用Cox比例风险回归模型探讨下咽鳞癌患者总生存及无病生存的独立影响因素。
　　结果：
　　1.qRT-PCR及Western blot检测结果显示RAC1 mRNA及蛋白在下咽鳞癌组织中的表达高于癌旁(P＜0.05)。
　　2.RAC1蛋白表达水平与下咽鳞癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期及复发具有相关性(P＜0.05)。
　　3.Kaplan-Meier生存分析显示在随访期内RAC1高表达组下咽鳞癌患者总生存率及无病生存率均低于RAC1低表达组(P＜0.05)。
　　4.Cox风险比例回归模型显示RAC1高表达是下咽鳞癌患者总生存的独立影响因素(P＜0.05)，病理低分化及RAC1高表达是下咽鳞癌患者无病生存的独立影响因素（P＜0.05）。
　　第二部分 RAC1对下咽鳞癌细胞增殖、侵袭能力的影响
　　目的：
　　观察RAC1对下咽鳞癌细胞增殖、细胞周期、凋亡及迁移侵袭等生物学行为的影响。
　　方法：
　　1.应用GSEA富集分析预测RAC1在下咽鳞癌中可能发挥的生物学作用。
　　2.将含有RAC1基因干扰片段及无关序列片段的质粒分别转染至下咽鳞癌FaDu细胞。
　　3.应用qRT-PCR和Western blot技术分别检测转染前后FaDu细胞中RAC1mRNA及蛋白的表达情况。
　　4.应用MTT实验检测下调RAC1对FaDu细胞生长的影响，克隆形成实验检测下调RAC1对FaDu细胞克隆形成的影响。
　　5.应用流式细胞术检测下调RAC1对FaDu细胞周期的影响，Western blot技术检测细胞周期相关蛋白的表达情况。
　　6.应用Hoechst染色实验及流式细胞术检测下调RAC1对FaDu细胞凋亡的影响，Western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1.GSEA富集分析显示下咽鳞癌中RAC1高表达与细胞周期及细胞黏附分子相关(P＜0.05)。
　　2.qRT-PCR及Western blot检测结果显示重组质粒转染后RAC1沉默组中RACl mRNA及蛋白的表达水平均低于Scramble组和Blank组(P＜0.01)，而Scramble组及Blank组之间的RAC1 mRNA及蛋白的表达水平无差异(P＞0.05)。
　　3.MTT实验结果显示shRAC1组在第24小时其OD值与Scramble组相比即出现明显下降(P＜0.05)，在第48h、72h、96h时间点其OD值仍低(P＜0.05)。
　　4.克隆形成实验结果显示shRAC1组克隆形成数明显低于Scramble组(P＜0.01)。
　　5.流式细胞术检测细胞周期结果显示，shRAC1组G0/G1期细胞比例显著高于Scramble组(P＜0.01)。
　　6.Western blot检测细胞周期相关蛋白的结果显示，shRAC1组中cyclinD1、cyclin B及cyclin E蛋白的表达均低于Scramble组(P＜0.05)。
　　7.Hoechst染色结果显示，shRAC1组凋亡细胞数显著高于Scramble组(P＜0.01)。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示，shRAC1组细胞总凋亡率显著高于Scramble组（P＜0.01）。
　　第三部分 RAC1对下咽鳞癌细胞裸鼠成瘤能力的影响
　　目的：
　　观察RAC1对下咽鳞癌细胞裸鼠成瘤能力的影响。
　　方法：
　　1.实验动物分组:18只健康裸鼠随机平均分为3组，腋窝皮下分别注射Blank、Scramble、shRAC1组FaDu细胞，构建下咽鳞癌裸鼠移植瘤模型。
　　2.观察裸鼠状态及成瘤时间，瘤体结节出现后每3天测量并记录瘤体大小。
　　3.30天后处死裸鼠并剥离肿物，称量瘤体重量。
　　4.HE染色观察各组移植瘤组织形态学变化。
　　5.应用Western blot技术检测各组移植瘤组织中RAC1蛋白的表达情况。
　　6.TUNEL实验检测各组移植瘤组织中凋亡的情况，免疫组织化学技术检测移植瘤组织中Ki67、E-cadherin的表达情况。
　　结果：
　　1.接种后第9天观察到肿瘤结节形成，接种第12天及以后shRAC1组瘤体平均大小均明显小于Scramble组(P＜0.01)。
　　2.shRAC1组移植瘤平均重量低于Scramble组(P＜0.01)。
　　3.HE染色结果显示，与Scramble组和Blank组相比，shRAC1组移植瘤组织中出现片状坏死，细胞皱缩变小，胞核固缩。
　　4.Western blot检测结果显示shRAC1组移植瘤组织中RAC1蛋白的表达水平低于Scramble组(P＜0.01)。
　　5.TUNEL实验结果显示Blank组及Scramble组移植瘤组织中几乎看不到凋亡细胞，而shRAC1组中凋亡染色细胞呈片状分布，shRAC1组移植瘤组织内 Ki67的染色强度及范围较Blank及Scramble组明显降低，而E-cadherin染色强度及范围明显升高。
　　第四部分 RAC1对下咽鳞癌增殖、侵袭能力影响的机制研究
　　目的：
　　探索RAC1影响下咽鳞癌增殖、侵袭能力的分子机制。
　　方法：
　　1.应用Western blot技术检测下咽鳞癌及癌旁组织中p-p38、p38的表达情况。
　　2.应用免疫荧光观察下调RAC1后FaDu细胞中p-p38的表达情况，应用Western blot技术检测下调RAC1对FaDu细胞中p-p38、p38蛋白表达的影响。
　　3.应用Western blot技术检测下调RAC1对FaDu细胞p38 MAPK通路中p38上游蛋白MKK3及其磷酸化蛋白表达的影响。
　　4.应用Western blot技术检测下调RAC1对下咽鳞癌裸鼠移植瘤组织内p-p38、p38及p-MKK3、MKK3蛋白表达的影响。
　　5.应用p38激动剂作用于shRAC1组细胞，将观察对象分为Scramble组、shRAC1+control组、shRAC1+activator组，应用MTT及克隆形成实验检测加入激动剂后各组细胞增殖的情况，Transwell实验检测各组细胞迁移侵袭的情况。
　　结果：
　　1.Western blot检测结果显示p-p38在下咽鳞癌组织中的表达高于癌旁(P＜0.05)。
　　2.免疫荧光染色结果显示在FaDu细胞中，shRAC1组磷酸化p38蛋白的表达相比Scramble组和Blank组明显减弱;Western blot检测结果显示在FaDu细胞中，shRAC1组p-p38及p-MKK3蛋白的表达均明显低于Scramble组(P＜0.01)。
　　3.Western blot检测结果显示在裸鼠移植瘤组织内，shRAC1组p-p38及p-MKK3蛋白的表达均明显低于Scramble组(P＜0.01)。
　　4.应用p38激动剂作用于shRAC1组细胞，MTT实验结果显示shRAC1+activator组细胞生长速度高于shRAC1+control组(P＜0.05)。
　　5.应用p38激动剂作用于shRAC1组细胞，克隆形成实验结果显示shRAC1+activator组克隆形成数高于shRAC1+control组(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.RAC1在下咽鳞癌组织中高表达，与下咽鳞癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、术后复发及预后显著相关，并且RAC1高表达是下咽鳞癌患者生存的独立影响因素。
　　2.下调RAC1通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来抑制下咽鳞癌细胞增殖，这些作用与细胞周期及凋亡相关蛋白的变化有关。
　　3.下调RAC1显著抑制下咽鳞癌细胞迁移侵袭，其抑制作用与EMT和MMP-2、MMP-9表达及活性下降有关。
　　4.下调RAC1显著抑制下咽鳞癌裸鼠移植瘤生长。
　　5.下咽鳞癌组织中p38广泛激活，RAC1对下咽鳞癌增殖、侵袭能力的影响部分是通过p38 MAPK信号通路来实现的。

目录

声明

摘要

缩略词索引

引言

第一部分 RAC1在下咽鳞癌组织中的表达及其临床意义

2．材料和方法

3．结果

4 讨论

5 小结

第二部分 RAC1对下咽鳞癌细胞增殖、侵袭能力的影响

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第三部分 RAC1对下咽鳞癌细胞裸鼠成瘤能力的影响

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．小结

第四部分 RAC1对下咽鳞癌增殖、侵袭能力影响的机制研究

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

5．小结

全文结论

参考文献

综述 RAC1与肿瘤发生发展及治疗的研究进展

博士期间发表论文

致谢